氨肽酶N抑制劑毛細(xì)管電泳在線篩選方法的研究.pdf

1、氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN)是屬于鋅離子依賴(lài)性金屬蛋白酶的一類(lèi)膜結(jié)合型外肽酶，以同源二聚體結(jié)構(gòu)存在于細(xì)胞膜。APN廣泛存在于大腦、腎、肝臟、胎盤(pán)和子宮等。與正常細(xì)胞相比，APN在癌細(xì)胞表面高水平表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤新血管的形成起著重要的作用，被稱(chēng)為腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)抗原CD13。近年來(lái)，以APN為靶點(diǎn)的腫瘤治療策略迅速發(fā)展起來(lái)，APN抑制劑已經(jīng)成為抗癌藥物研究的熱點(diǎn)課題。因此，發(fā)展和建立快速、可靠及高

2、通量APN抑制劑篩選方法對(duì)于研發(fā)新藥物具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)具有樣品消耗量少、分離效率高、分析時(shí)間短及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于酶反應(yīng)的測(cè)定中，成為了酶活性及酶抑制劑篩選研究常使用的分析手段。電泳調(diào)控微分析法(Electrophoretically Mediated Microanalysis，EMMA)是以毛細(xì)管電泳柱進(jìn)樣端約1.5～2.0 cm

3、部分作為反應(yīng)的微室，將酶溶液和底物溶液依次進(jìn)樣到毛細(xì)管中，接著施加一段時(shí)間小電壓讓酶和底物溶液在毛細(xì)管中充分混合并反應(yīng)，當(dāng)酶促反應(yīng)進(jìn)行完畢后，加一高電壓對(duì)酶促反應(yīng)生成的產(chǎn)物和未反應(yīng)的底物進(jìn)行分離，隨后進(jìn)行檢測(cè)。該法在同一根毛細(xì)管內(nèi)集成了混合、反應(yīng)、分離及檢測(cè)的全過(guò)程。本課題建立了APN抑制劑的毛細(xì)管電泳在線篩選方法，為抗腫瘤藥物的研究開(kāi)發(fā)提供了新的篩選模型。主要研究工作和成果如下:
　　1.本文建立了APN抑制劑EMMA篩選方法，

4、并將該法應(yīng)用于APN抑制劑的活性篩選研究中。電泳條件采用熔融石英毛細(xì)管(內(nèi)徑75μm，有效長(zhǎng)度為50cm)，柱溫37℃，分離體系30 mM HEPES緩沖溶液含40 mM脫氧膽酸鈉(pH7.7)，分離電壓25 kV，二極管陣列檢測(cè)器(DAD)檢測(cè)波長(zhǎng)為380 nm。EMMA法中，孵育緩沖溶液（50 mM磷酸鹽緩沖溶液，pH7.7）、APN溶液、底物溶液（含內(nèi)標(biāo)）及孵育緩沖溶液液依次在0.5 psi壓力下分別進(jìn)樣10s，在±2.0 kV各

5、加壓6s使酶和底物混合，在+1.0 kV電壓，孵育2 min后，在毛細(xì)管兩端加25 kV電壓，經(jīng)酶解后生成的產(chǎn)物、內(nèi)標(biāo)與未完全反應(yīng)剩余的底物，在電滲作用下進(jìn)入毛細(xì)管分離區(qū)，依據(jù)各自遷移速率的不同而實(shí)現(xiàn)電泳分離。利用建立的方法測(cè)定了氨肽酶N的動(dòng)力學(xué)參數(shù)（Km和Vmax）發(fā)現(xiàn)測(cè)得的動(dòng)力學(xué)參數(shù)值與文獻(xiàn)報(bào)道值一致，以此證明在該模型中酶的活性保持良好。以烏苯美司為陽(yáng)性對(duì)照，用所建立的方法制作量-效曲線同時(shí)測(cè)定其IC50，與文獻(xiàn)報(bào)道的酶標(biāo)法測(cè)定值比

6、較，驗(yàn)證了篩選方法的可行性。最后采用EMMA氨肽酶N抑制劑篩選方法從山東大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)研究所提供的以APN為靶點(diǎn)合成的29個(gè)合成新化合物（包括2個(gè)化合物粗合成物，含量約50％）進(jìn)行APN抑制劑的篩選研究。
　　2.通過(guò)細(xì)胞膜制備技術(shù)得到高表達(dá)APN的人卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞(ES-2)的細(xì)胞膜，測(cè)定細(xì)胞膜蛋白質(zhì)含量和膜APN活性對(duì)其進(jìn)行表征后，將活性細(xì)胞膜填充至毛細(xì)管進(jìn)樣端形成酶促反應(yīng)微室，毛細(xì)管剩余部分作為酶促反應(yīng)產(chǎn)物和未反應(yīng)完

7、的底物的分離通道，建立了APN抑制劑的細(xì)胞膜毛細(xì)管電泳篩選方法。烏苯美司作為陽(yáng)性抑制劑，用所建立的方法制作量-效曲線同時(shí)測(cè)得烏苯美司的半抑制劑濃度IC50值為19.3μM，與文獻(xiàn)報(bào)道的烏苯美司的IC50值(20.5μM)結(jié)果一致。順鉑為陰性抑制劑并選擇以低表達(dá)APN的人慢性髓系白血病細(xì)胞(K562)的細(xì)胞膜作陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了篩選方法的可行性。利用建立的細(xì)胞膜毛細(xì)管電泳法測(cè)定了細(xì)胞膜上APN的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km)發(fā)現(xiàn)測(cè)得的細(xì)胞膜上A