海腎螢光素酶生物發(fā)光底物及探針的設(shè)計、合成和活性研究.pdf

1、生物發(fā)光(Bioluminescence)是指生物體內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)在酶的作用下產(chǎn)生可見光的現(xiàn)象，該過程不依賴于機(jī)體對光的吸收，是將生物能轉(zhuǎn)化為光能的過程。而化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence)是不需要酶的參與，只依靠化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生可見光的現(xiàn)象。生物發(fā)光現(xiàn)象廣泛存在于自然界生物有機(jī)體中，包括細(xì)菌、昆蟲和海洋生物等。生物發(fā)光成像(Bioluminescence imaging)是通過靈敏的光學(xué)檢測儀器監(jiān)控螢光素酶標(biāo)記的細(xì)胞或基因在活體

2、生物內(nèi)的活動和行為過程的一種新興的成像技術(shù)。生物發(fā)光成像技術(shù)具有操作簡便快速、靈敏度高、能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時動態(tài)觀測以及非侵襲性等優(yōu)點(diǎn)。生物發(fā)光成像技術(shù)在腫瘤生長監(jiān)測和轉(zhuǎn)移示蹤、目標(biāo)基因表達(dá)的檢測、蛋白-蛋白相互作用、藥物高通量篩選和細(xì)胞內(nèi)ATP水平探測等領(lǐng)域有著不可替代的技術(shù)優(yōu)勢。
　　海腎螢光素酶發(fā)光體系是常見的生物發(fā)光體系之一。該體系需要海腎螢光素酶（Renilla luciferase）、底物腔腸素(coelenterazine)

3、以及分子氧的參與，最終產(chǎn)生可見光。海腎螢光素酶發(fā)光體系簡單，不需要ATP、Mg2+等輔助因子，此外海腎螢光素酶能夠表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞中并且無細(xì)胞毒性。然而該體系在生命科學(xué)中若得到更廣泛的應(yīng)用，還需要克服以下缺點(diǎn):第一，發(fā)射波長較短(450-475 nm)，容易被組織吸收，不利于動物成像;第二，穩(wěn)定性較差，在中性或堿性介質(zhì)中容易被氧化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，從而升高了背景信號。目前，科學(xué)家們已經(jīng)對腔腸素的C-2、C-5、C-6和C-8取代位置進(jìn)行了

4、修飾改造，然而具有較好性質(zhì)的底物卻寥寥無幾，其主要原因是被改造的腔腸素類似物不能夠很好地被海腎螢光素酶所識別。DeepBlueCTM是一種可以商業(yè)獲得的腔腸素類似物，已經(jīng)被用于生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移研究，并且其化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單，與天然的腔腸素相比少了兩個羥基，所以在研究中科學(xué)家常以此為參照進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。
　　本研究課題主要分為三個部分:首先以DeepBlueCTM為參照進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到了一個活性更好的腔腸素類似物;在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用前藥

5、策略設(shè)計評價了一批酯類腔腸素衍生物;最后設(shè)計并合成了一個用于檢測毒性物質(zhì)苯硫酚的生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光探針。本研究對海腎生物發(fā)光成像技術(shù)的推廣與應(yīng)用具有有較重要的意義。
　　第一部分（底物改造）:以DeepBlueCTM為參照對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，以獲得波長紅移且穩(wěn)定的海腎螢光素酶發(fā)光底物。分別合成了兩個含氧和含硫的腔腸素類似物，因為屬于同一主族的氧和硫具有相似的性質(zhì)，都能夠與雜環(huán)形成p-π共軛，這樣可使發(fā)射波長紅移。然后采用了經(jīng)過純化的

6、海腎螢光素酶對這些化合物進(jìn)行了體外生物發(fā)光性質(zhì)研究，并在細(xì)胞水平上作了相關(guān)研究。結(jié)果表明，在體外含氧的腔腸素類似物顯示了較大的紅移(63 nm)，但是量子產(chǎn)率有所下降。在細(xì)胞水平上，含氧的腔腸素類似物表現(xiàn)出較低的發(fā)光強(qiáng)度，而含硫的腔腸素類似物的生物發(fā)光強(qiáng)度是最強(qiáng)的。
　　第二部分（酯類腔腸素衍生物的設(shè)計）:為了提高腔腸素類似物的穩(wěn)定性并且延長發(fā)光時間，在發(fā)光最好的含硫腔腸素類似物的3位羰基上引入了保護(hù)基團(tuán)，形成羧酸酯和碳酸酯結(jié)構(gòu)。

7、此保護(hù)基團(tuán)可以在細(xì)胞內(nèi)被酯酶、脂肪酶、親核性物質(zhì)水解，進(jìn)而釋放出含硫的腔腸素類似物，該底物再與細(xì)胞內(nèi)的海腎螢光素酶作用產(chǎn)生生物發(fā)光。被保護(hù)的腔腸素類似物不能直接被海腎螢光素酶識別作用，因此不能產(chǎn)生光信號。此部分總共合成了10個酯類腔腸素類似物，由于保護(hù)基團(tuán)的位阻不同，其在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)發(fā)光時間的時間不同。此外也進(jìn)行了體內(nèi)研究，構(gòu)建了裸鼠腋下移植瘤模型，結(jié)果表明這些化合物能夠延長生物發(fā)光時間，達(dá)到了最初的目的。
　　第三部分（苯硫酚探針

8、的設(shè)計）:與熒光成像相比，生物發(fā)光成像具有一定的優(yōu)勢:不需要激發(fā)光照射、背景信號低、良好的生物相容性、靈敏度高等。因此，基于生物發(fā)光原理的探針已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)。目前大多數(shù)的生物發(fā)光探針都是基于對螢火蟲螢光素結(jié)構(gòu)的改造，而基于海腎螢光素酶體系的生物發(fā)光探針很少。我們設(shè)計并合成了一個用于檢測毒性物質(zhì)苯硫酚的生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光探針，在含硫的腔腸素類似物的3位羰基處引入了2，4-二硝基苯醚，該保護(hù)基團(tuán)能夠被具有強(qiáng)親核性的苯硫酚選擇性地脫去，從

9、而釋放出含硫的腔腸素類似物。腔腸素類似物不僅能夠產(chǎn)生生物發(fā)光，而且還能在體外通過DMSO等氧化物質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。該探針具有較高的靈敏度和選擇性，能夠在水溶液、細(xì)胞以及血漿中檢測毒性物質(zhì)苯硫酚，是很有潛力的生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光探針。
　　綜上所述，為了找到量子產(chǎn)率高、發(fā)射波長紅移的海腎螢光素酶發(fā)光底物，我們在DeepBlueCTM的C-8位引入了硫原子，使其與雜環(huán)形成p-π共軛，而且所改變的部分很小，盡量保證了底物與酶的識別作用，接著

10、通過體外酶水平和細(xì)胞水平上的研究驗證了這一設(shè)想。腔腸素3位羰基是其生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光的關(guān)鍵活性部位，如果運(yùn)用前藥原理先將羰基保護(hù)起來，并使其在特定的條件下被釋放出來，就可以提高腔腸素及其類似物的穩(wěn)定性。我們分別設(shè)計了10個能夠緩慢釋放腔腸素類似物底物的酯類化合物和一個能夠檢測毒性物質(zhì)苯硫酚的發(fā)光探針，接著對這些化合物進(jìn)行了體內(nèi)外活性評價。作為生物發(fā)光的重要成員，以腔腸素類似物為底物的生物發(fā)光還需要進(jìn)一步地研究開發(fā)，而將前藥原理運(yùn)用到生物