納米羥基磷灰石誘導(dǎo)人牙周膜細胞骨化分化的研究.pdf

1、近十年來的研究進一步表明，牙周膜細胞(periodontalligamentcells，PDLCs)是具有多種細胞表型的細胞群。根據(jù)其功能和性質(zhì)可分為成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞和成纖維細胞亞群。前二者由于具有形成礦化組織的功能又統(tǒng)稱為骨化亞群。分別具有形成牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周膜膠原纖維的潛能。只有PDLC的增殖并形成相應(yīng)的組織，才能形成包埋牙周韌帶的兩端硬組織和牙周韌帶本身。同時，在PDLC中存在這些細胞的前體細胞。只有誘導(dǎo)這些前體細胞分化

2、，首先是向骨化亞群的分化，才能夠形成牙周結(jié)締組織附著的錨地。因而，GTR技術(shù)以誘導(dǎo)PDLC骨化功能的分化作為其核心內(nèi)容。但目前尚缺乏理想的誘導(dǎo)PDLC分化的材料。 本研究在制備納米羥基磷灰石，并對其顯微結(jié)構(gòu)測量分析基礎(chǔ)上，采用細胞培養(yǎng)技術(shù)，就納米羥基磷灰石對PDLC的細胞形態(tài)、細胞增殖、骨化亞群分化等作初步研究，以評價納米羥基磷灰石在引導(dǎo)牙周組織再生治療中的意義。 本研究包括三個部分： 第一部分納米羥基磷灰石的制

3、備和檢測分析 目的制備實驗使用的材料并對其作掃描電鏡、透射電鏡和能譜分析，以確定材料的顯微特征和成分。 材料和方法采用溶膠-凝膠法。以四水硝酸鈣水溶液和磷酸三甲脂作為前驅(qū)體。在四水硝酸鈉水溶液中加入5％枸櫞酸作為鰲合劑。按Ca與P原子比為5：3配制溶液。室溫下混合，并用氨水調(diào)整至pH7.5。反應(yīng)48h后，在190℃干燥2h，形成凝膠。600℃鍛燒1h，碾成粉末備用。通過掃描電鏡、透射電鏡、X線衍射分析和能譜分析，觀察其理

4、化特征。 結(jié)果掃描電鏡7000倍下可見，納米HA顆粒大小平均小于1μm。從顆粒的情況可見以枸櫞酸為前驅(qū)體，可明顯阻止HA晶體團聚，使晶體分散均勻。在透射電鏡下觀察可見大量納米相HA顆粒，平均晶體大小小于50nm。 結(jié)論螯合劑的加入使溶膠變?yōu)榉€(wěn)定的凝膠，水解和縮聚反應(yīng)后形成的羥基磷灰石被有機物均勻的分隔，羥基磷灰石膠體粒子在加熱的過程中難以接近，從而減少了粉體的團聚，最終形成均勻分散的納米級粉體。 第二部分納米羥基

5、磷灰石對人牙周膜細胞生長的影響 目的研究納米羥基磷灰石材料對牙周膜細胞的細胞毒性及人牙周膜細胞與納米羥基磷灰石作用后細胞形態(tài)的變化。 材料和方法采用差異酶消化法原代培養(yǎng)人牙周膜細胞。牙離體后刮取根中三分之二的牙周膜，用剪刀反復(fù)剪碎后，加入0.1％膠原酶，37℃振蕩消化，見組織松散，加0.125％胰蛋白酶，繼續(xù)消化，見大部分細胞游離，終止消化。離心，細胞再懸，接種培養(yǎng)。用0.25％胰蛋白酶消化生長狀態(tài)良好的第4代人牙周膜細

6、胞，稀釋使之形成密度為1×104/ml單細胞懸液。按設(shè)計加入納米羥基磷灰石、致密羥基磷灰石和空白對照。培養(yǎng)2、3、4天后，采用MTT法測得OD值。加入材料后培養(yǎng)至第5天，作倒置顯微鏡、掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡細胞形態(tài)學觀察及能譜分析。 結(jié)果原代培養(yǎng)的PDLC在37℃孵箱中培養(yǎng)24h后開始貼壁，48h后，大部分細胞貼壁。從第3天起，細胞生長加速，6天后開始形成單層，長梭形細胞占絕對優(yōu)勢。 MTT實驗表明，加入納米羥基

7、磷灰石材料后第2天細胞增殖明顯，第3天后，nano-HA組的細胞增殖速度加快，第4天nano-HA組細胞數(shù)目較其它二組明顯提高。而致密羥基磷灰石組與對照組無顯著性差異。細胞增殖在第4天達峰值。 倒置顯微鏡下，經(jīng)納米羥基磷灰石誘導(dǎo)3天后，細胞生長狀態(tài)良好，細胞突起變長。掃描電鏡觀察：納米羥基磷灰石培養(yǎng)牙周膜細胞后，細胞呈多角形生長。細胞漿呈許多伸展偽腳，細胞表面有大量顆粒狀物黏附，有些顆粒明顯位于細胞內(nèi)。透射電鏡觀察：納米羥基磷灰

8、石組細胞內(nèi)見大量粒徑約5nm左右的顆粒團。其電子密度明顯高于周圍細胞漿和細胞器。吞噬顆粒的細胞其細胞線粒體增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核清晰可見。從細胞形態(tài)看，吞噬了大量羥基磷灰石顆粒的牙周膜細胞，細胞形態(tài)正常。 結(jié)論用膠原酶使牙周膜組織松散，然后再用胰酶消化使之成為單細胞懸液，可在短時間內(nèi)獲得大量牙周膜細胞。納米羥基磷灰石對人牙周膜細胞有明顯的促進增殖作用，并可以被人牙周膜細胞吞噬，吞入納米磷灰石粒子后細胞生長良好，表明本材料生物相

9、容性良好，而且是一種新型可吸收的生物材料。 第三部分納米羥基磷灰石對人牙周膜細胞骨化分化的影響 目的研究納米羥基磷灰石材料對牙周膜細胞骨化亞群分化的作用。探討其在誘導(dǎo)牙周膜細胞前體細胞分化的意義。 材料和方法加入實驗材料后第5、8天測定堿性磷酸酶活性。用無Ca2+-Mg2+-PBS洗滌細胞2次。細胞刮將細胞收集到細胞裂解液，凍融3次，超聲破碎細胞，4℃離心，取上清，按堿性磷酸酶試劑盒加入試劑，測OD值。加入材料后

10、培養(yǎng)至第5天，按程序進行抗堿性磷酸酶免疫組化染色。其余細胞用0.25％胰蛋白酶消化，離心再懸后，按程序作抗ALP陽性細胞流式細胞檢測。 結(jié)果不同刺激組細胞培養(yǎng)5天、8天后，按上述步驟處理比色測定OD值。結(jié)果顯示，納米羥基磷灰石組、致密羥基磷灰石組和對照組OD值有非常顯著性差異。在細胞爬片上，抗ALP免疫組化染色：nano-HA組大部分細胞出現(xiàn)ALP陽性表達，染色較深，而dense-HA組大部分細胞亦出現(xiàn)陽性，但染色較淡。第5天和

11、第8天做流式細胞檢測：在細胞計數(shù)相同的情況下，nano-HA組細胞抗ALP陽性細胞數(shù)分布明顯高于dense-HA組和對照組，nano-HA組陽性細胞分布線一般位于最前端，空白對照組居最末。 結(jié)論羥基磷灰石的納米化粒子提高了材料促進成纖維細胞骨化分化的能力。與致密羥基磷灰石相比，納米羥基磷灰石具有促進細胞增殖并向骨化亞群分化的作用。 綜上所述，本研究通過制備的納米羥基磷灰石對人牙周膜細胞培養(yǎng)實驗表明，納米相羥基磷灰石與致密