調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與Th17細(xì)胞在支氣管哮喘中失衡表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、支氣管哮喘（Asthma，Bronchial asthma，簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是全球最常見(jiàn)的慢性疾病之一。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界目前大約有3億哮喘患者，且有證據(jù)顯示目前哮喘患病率以每年1%左右的速度遞增，嚴(yán)重影響患者的日常生活，給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此對(duì)支氣管哮喘進(jìn)行深入的研究具有深遠(yuǎn)的社會(huì)意義。 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，哮喘的一些實(shí)驗(yàn)和臨床現(xiàn)象并不能完全用Th1/Th2失衡理論來(lái)解釋?zhuān)徊⑶矣醒芯堪l(fā)現(xiàn)Th1細(xì)胞可以加重過(guò)敏癥和哮喘，

2、Th1細(xì)胞因子IFN-γ與抗原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)和嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。而Treg既能抑制Th1細(xì)胞，也能抑制Th2細(xì)胞，用Treg細(xì)胞可更好的解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制，因此近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)。Th17細(xì)胞是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的不同于Th1和Th2的另一種CD4+T細(xì)胞的新亞型，具有IL-23依賴(lài)性產(chǎn)生IL-17的特性，研究發(fā)現(xiàn)其與Treg之間存在復(fù)雜的相關(guān)關(guān)系，并且與支氣管哮喘也有關(guān)。因此既然Th1/Th2細(xì)胞亞群比例和功能的失衡是支氣管哮喘重要的免疫

3、異常，是哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，那么是否在哮喘中同樣也存在Treg/Th17亞群比例和功能的失衡，這個(gè)問(wèn)題值得我們?nèi)ド钊胙芯俊?目的: 1、探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）與Th17細(xì)胞及相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、RORγt在支氣管哮喘中的失衡表達(dá)；2、探討Treg與Th17細(xì)胞及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3與RORγt表達(dá)量的比值與氣道炎癥的相關(guān)關(guān)系。 方法: 1、小鼠哮喘模型的建立及評(píng)價(jià) 30只雌性SPF級(jí)

4、Balb/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、哮喘組和地塞米松治療組；哮喘組于第0d、7d、14d（腹腔+皮下）注射0.2ml致敏液（含20ug0VA，20mg AL（OH）3），第21-27d霧化吸入5%OVA激發(fā)；地塞米松治療組于21至27d霧化吸入5%OVA激發(fā)前30min腹腔注射地塞米松（1mg/Kg）；正常對(duì)照組則用生理鹽水替代OVA致敏和激發(fā)；利用無(wú)創(chuàng)小鼠體描儀通過(guò)全身性體積描記法觀察各組小鼠氣道反應(yīng)性；通過(guò)肺組織石蠟切片蘇

5、木素-伊紅（HE）染色觀察各組氣道病理改變；用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-5、IFN-γ含量。 2、調(diào)節(jié)T細(xì)胞與Th17細(xì)胞在支氣管哮喘小鼠中的失衡以及與氣道炎癥的相關(guān)性分析 用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)各組小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中IL-10、IL-17含量；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測(cè)定法檢測(cè)肺組織IL-10mRNA、IL-17 mRNA的表達(dá)；通過(guò)各組小鼠脾臟制備脾細(xì)胞單

6、細(xì)胞懸液，利用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)各組CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞和CD4+IL-17+細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例。 3、轉(zhuǎn)錄因子Foxp3/RORγt在支氣管哮喘小鼠中失衡表達(dá)以及與氣道炎癥的相關(guān)性分析 用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)各組小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中IL-10、IL-17含量；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測(cè)定法檢測(cè)肺組織IL-10mRNA、IL-17mRNA、Foxp3mRNA和RORγtmRN

7、A的表達(dá)；用免疫組化及免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)肺組織中Foxp3和RORγt蛋白的表達(dá)。 結(jié)果: 1、成功建立小鼠哮喘模型。哮喘組所有小鼠在霧化過(guò)程中均出現(xiàn)不同程度的煩躁不安或安靜少動(dòng)、呼吸加快加深、點(diǎn)頭呼吸、弓背直立、前肢縮抬，二便失禁等哮喘速發(fā)相反應(yīng)表現(xiàn)。 同等劑量乙酰膽堿激發(fā)（3.125、6.25、12.5、25、50mg/ml）的氣道反應(yīng)性檢測(cè)中，哮喘組小鼠%△Penh明顯高于正常對(duì)照組

8、。 哮喘組小鼠細(xì)支氣管及伴行血管周?chē)罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道壁和肺組織中可見(jiàn)以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管管壁增厚、管腔狹窄，支氣管管腔內(nèi)可見(jiàn)粘液栓，粘膜皺壁減少，杯狀細(xì)胞增生，肺泡間隔不同程度增寬，部分?jǐn)嗔?，形成肺氣腫。 哮喘組小鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于正常對(duì)照組（P<0.01）。 哮喘組小鼠肺泡灌洗液中IL-5水平明顯高于正常對(duì)照組（P<0.

9、01）；與之相反，哮喘組小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ水平低于正常對(duì)照組（P<0.01）。 2、同等劑量乙酰膽堿激發(fā)（3.125、6.25、12.5、25、50mg/ml）的氣道反應(yīng)性檢測(cè)中，哮喘組小鼠%△Penh明顯高于正常對(duì)照組小鼠（P<0.01），地塞米松治療組小鼠%△Penh較哮喘組明顯降低（P<0.01）；在乙酰膽堿濃度為3.125、6.25、12.5mg/ml激發(fā)時(shí)，正常對(duì)照組和地塞米松治療組小鼠%△Penh相似，差異無(wú)

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在乙酰膽堿濃度為25、50mg/ml激發(fā)時(shí)，地塞米松治療組小鼠%△Penh高于正常對(duì)照組小鼠（P<0.01）。 哮喘組肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均較正常對(duì)照組明顯增多（P<0.01）；地塞米松治療組與哮喘組相比中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少（p<0.01），與正常對(duì)照組比較仍較高（P<0.01）。 哮喘組小鼠肺泡灌洗液、血清中IL-17水平較正常對(duì)

11、照組明顯升高（P<0.01）；地塞米松治療組肺泡灌洗液、血清中IL-17水平較哮喘組有所下降，但與正常對(duì)照組比較仍較高（p<0.01）；與之相反，哮喘組小鼠肺泡灌洗液、血清中IL-10水平較正常對(duì)照組明顯下降（p<0.01）；地塞米松治療組肺泡灌洗液、血清中IL-10水平較哮喘組有所升高，但與正常對(duì)照組比較仍較低（p<0.01）。 哮喘組小鼠肺組織中細(xì)胞因子IL-17mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組小鼠明顯增強(qiáng)（p<0.01）；地塞米

12、松治療組小鼠肺組織IL-17mRNA的表達(dá)減弱，明顯低于哮喘組小鼠（P<0.01），但與正常對(duì)照組小鼠比較仍較高（P<0.01）。哮喘組小鼠肺組織中細(xì)胞因子IL-10mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組小鼠明顯減弱（P<0.01）；地塞米松治療組小鼠肺組織IL-10mRNA的表達(dá)較哮喘組小鼠有所增強(qiáng)（p<0.01），但與正常對(duì)照組小鼠比較仍較低（p<0.01）。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示哮喘組CD4+細(xì)胞中淋巴細(xì)胞亞群CD4+CD25+Fo

13、xp3+細(xì)胞百分率顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01）；地塞米松治療組CD4+細(xì)胞中淋巴細(xì)胞亞群CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞百分率較哮喘組小鼠有所增加（P<0.01），但與正常對(duì)照組小鼠比較仍較低（P<0.01）。哮喘組CD4+細(xì)胞中淋巴細(xì)胞亞群CD4+IL-17+細(xì)胞百分率顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01）；地塞米松治療組CD4+細(xì)胞中淋巴細(xì)胞亞群CD4+IL-17+細(xì)胞百分率較哮喘組小鼠有所減少（P<0.01），但與正常對(duì)照組小

14、鼠比較仍較高（P<0.01）。哮喘組CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞/CD4+IL-17+細(xì)胞比例較正常對(duì)照組下降（P<0.01）；地塞米松治療組CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞/CD4+IL-17+細(xì)胞比例較哮喘組小鼠有所增加（P<0.01），但與正常對(duì)照組小鼠比較仍較低（P<0.01）。 3、哮喘組小鼠肺組織中轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組小鼠明顯增強(qiáng)（P<0.01）；地塞米松治療組小鼠肺組織RORγt

15、mRNA的表達(dá)減弱，明顯低于哮喘組小鼠（P<0.01），但與正常對(duì)照組小鼠比較仍較高（P<0.01）。哮喘組小鼠肺組織中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組小鼠明顯減弱（P<0.01）；地塞米松治療組小鼠肺組織Foxp3 mRNA的表達(dá)較哮喘組小鼠有所增強(qiáng)（P<0.01），但與正常對(duì)照組小鼠比較仍較低（P<0.01）； Foxp3/RORγt mRNA表達(dá)量比值哮喘組（0.18±0.05）較正常對(duì)照組（1.97±0.58）明顯

16、降低（P<0.01）；地塞米松治療組Foxp3/RORγt mRNA表達(dá)量比值為（0.59±0.14），與哮喘組Foxp3/RORγt mRNA表達(dá)量比值比較有所升高（P<0.01），但仍低于正常對(duì)照組（1.97±0.58）（P<0.01）。 結(jié)論: 1、通過(guò)對(duì)致敏劑及致敏方法的改進(jìn)，使我們更容易成功建立小鼠哮喘動(dòng)物模型，為隨后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供了一個(gè)很好的基礎(chǔ)；利用無(wú)創(chuàng)小鼠體描儀通過(guò)全身性體積描記法可方便的觀察實(shí)驗(yàn)小鼠

17、氣道反應(yīng)性，為進(jìn)一步研究支氣管哮喘的病理生理學(xué)機(jī)制提供了很好的工具和手段。 2、在支氣管哮喘中存在Treg與Th17的失衡，表現(xiàn)為CD4+細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞減少，CD4+IL-17+細(xì)胞增多，CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞/CD4+IL-17+細(xì)胞比例低下，反映哮喘的免疫失衡；并且CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞/CD4+IL-17+細(xì)胞比例與氣道炎癥各指標(biāo)呈直線相關(guān)，Treg與Th17的失衡很可能是