PTEN基因和Th1-Th2細胞因子在兒童支氣管哮喘中的作用研究.pdf

1、一.研究背景
　　 支氣管哮喘（簡稱哮喘）目前在全球范圍內(nèi)有較高的發(fā)病率，并呈逐漸上升的趨勢，是當今世界威脅公共健康最常見的慢性肺部疾病，是發(fā)達國家中兒童支氣管疾病發(fā)病率最高的一種。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的報告指出，目前全球約有3億哮喘患者，其所造成的社會負擔超過了結(jié)核病和艾滋病的總和。我國的哮喘患者已達3000萬以上，其死亡率位列全球第一。因此，支氣管哮喘已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)亟待解決的公共衛(wèi)生難題。
　　 哮喘是

2、由免疫、遺傳和環(huán)境等多重因素共同作用的結(jié)果，其發(fā)病機制目前尚未完全明了。既往的研究多集中在Th2介導的嗜酸性粒細胞性炎癥。近幾年，隨著遺傳學和分子生物學的不斷發(fā)展，哮喘遺傳病因?qū)W成為研究的熱點。對哮喘遺傳機制及其相關基因研究已逐步深入，并證實哮喘是一種多基因遺傳病。目前報道已有超過100個基因與哮喘發(fā)病相關，如5q31、6p21上的MHC分子，7q、14q上的T細胞受體基因，11q12、11q13、12q13-24、13q14、20p1

3、3等。
　　 10號染色體上磷酸酶與張力蛋白同源缺失性基因(Phosphatase and tensinhomolog deleted on chromosome 10，PTEN)是1997年由Steck等3個研究小組先后發(fā)現(xiàn)的一個具有雙重特異磷酸酶活性的抑癌基因，是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN基因定位于10q23.3上，全長200kb，包含9個外顯子和8個內(nèi)含子，編碼由403個氨基酸組成的細胞質(zhì)蛋白，相對

4、分子量為50000。PTEN基因主要通過磷酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol(-)3-kinase，PI3K/Akt)信號轉(zhuǎn)導途徑的負性調(diào)控，對細胞增殖、生長、凋亡、黏附、遷移和血管生長等進行調(diào)節(jié)，在維持細胞的結(jié)構和信號轉(zhuǎn)導等方面起重要作用。目前除第9外顯子未發(fā)現(xiàn)有基因突變，其余8個外顯子均發(fā)現(xiàn)有突變，其中第5、第8外顯子有較高的突變率。PTEN基因是繼p53基因之后發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤中突變率最高的抑癌基因。目前已在

5、惡性膠質(zhì)瘤、原發(fā)性乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、肝癌等腫瘤中證實了存在這種基因的表達異常。PTEN基因及其調(diào)控信號轉(zhuǎn)導異常涉及多個系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因而研究PTEN基因及其介導的信號轉(zhuǎn)導途徑可為治療疾病新策略研發(fā)提供一定理論依據(jù)。
　　 近年，PTEN基因在過敏性氣道炎癥中的作用也越來越受到關注。韓國學者Yong等通過動物實驗研究首次報道了PTEN可能通過抑制哮喘模型鼠氣道內(nèi)嗜酸粒細胞(eosinophils，EO

6、S)脫顆粒和活化，降低IL-4、IL-5的濃度，從而減輕嗜酸性粒細胞炎癥和氣道高反應性。Lee等研究提示，PTEN可通過下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達，減輕氣道炎癥和炎性滲出。Adachi等發(fā)現(xiàn)，PTEN基因在過敏性炎癥反應中通過嗜酸粒細胞存活和趨化的負向調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。近年國外學者發(fā)現(xiàn)PTEN對肺組織干細胞的動態(tài)平衡及分化也起重要作用，可對肺損傷起保護作用

7、。國內(nèi)動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，氣道上皮細胞是PTEN主要表達細胞，哮喘大鼠PTEN蛋白表達明顯減少，PTEN可減少Th2細胞因子的表達，從而影響Th1/Th2細胞因子的平衡狀態(tài);研究發(fā)現(xiàn)地塞米松可通過上調(diào)PTEN的表達而控制哮喘發(fā)作，這可能為地塞米松抑制哮喘氣道炎癥形成的重要作用機制。多項體外實驗發(fā)現(xiàn)，上調(diào)PTEN表達能有效抑制人氣道平滑肌細胞的增殖，可能主要是通過抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導途徑而起作用的。目前國內(nèi)外對于PTEN基因突變與支

8、氣管哮喘的相關性研究報道較少。
　　 嗜酸粒細胞的浸潤是支氣管哮喘的重要特征，嗜酸粒細胞是變應性疾病中最活躍的一類細胞。速發(fā)型變應性疾病的組織和器官的局部以及滲出液中均有大量的嗜酸粒細胞浸潤，這是變應性發(fā)作的一個重要特征。嗜酸粒細胞的聚集和活化是支氣管哮喘發(fā)病機制中的中心環(huán)節(jié)。多項動物實驗通過剔除嗜酸粒細胞基因及人體實驗通過使用抗IL-5單抗，使嗜酸粒細胞缺失，均證實了嗜酸粒細胞活化在哮喘的發(fā)病中起關鍵作用。嗜酸粒細胞在Th2類

9、細胞參與的氣道過敏性炎癥中也起發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。它對于哮喘的發(fā)作、預后的判斷和藥物療效的評價有重要作用，因此嗜酸粒細胞已經(jīng)成為哮喘治療的一個有力的標靶。
　　 主要由嗜酸粒細胞、肥大細胞、T輔助細胞(Th細胞)等炎癥細胞參與的慢性過敏性氣道炎癥是支氣管哮喘的主要特征之一。CD4+T細胞（即Th細胞）是T細胞的一種重要細胞亞群，是哮喘發(fā)生和發(fā)展過程中最重要的調(diào)控者。未致敏的CD4+T細胞(Th0細胞)在受到抗原刺激后主要分化為Th

10、1和Th2兩個細胞亞群。正常人Th1/Th2類細胞因子互相依存和制約，保持動態(tài)平衡。近年來由學者提出了Th1/Th2類細胞因子失衡學說，即Th1/Th2細胞平衡失調(diào)，機體正常的免疫耐受功能受損，從而導致免疫細胞及其成分對機體自身組織結(jié)構和功能的破壞，是哮喘發(fā)病的重要機制。Th2類細胞主要通過分泌Th2類細胞因子而發(fā)揮致病作用。Th2類細胞因子，以IL-4、IL-5為代表，對血漿IgE水平升高、趨化因子分泌過多、氣道嗜酸粒細胞增多、氣道平

11、滑肌增生肥大、黏液分泌增多等均起關鍵作用。Th1類細胞則主要通過分泌干擾素(IFN-γ)減輕氣道過敏性炎癥，對哮喘的發(fā)病起保護防御作用。IL-4，又稱B細胞刺激因子1，是主要由Th2細胞產(chǎn)生的一種細胞因子。是一種多功能的炎性介質(zhì)，在免疫反應中發(fā)揮著重大作用。IL-5是是調(diào)節(jié)嗜酸粒細胞功能最主要的調(diào)節(jié)因子，它與支氣管哮喘發(fā)作時嗜酸粒細胞反應有直接的關系，它在嗜酸粒細胞的募集、活化、趨化及增殖等方面起著重要作用，對過敏反應進程起到關鍵作用。

12、IFN-γ是Th1細胞因子的典型代表，具有調(diào)節(jié)嗜酸粒細胞的活化、分化和募集的作用，有利于Th1細胞的分化，而抑制Th2細胞的分化，使Th1和Th2兩個細胞亞群達到平衡狀態(tài)，從而使哮喘患者的氣道炎癥得到控制。
　　 二.研究目的
　　 本實驗擬探討PTEN基因突變與兒童支氣管哮喘的相關性，以及其與嗜酸粒細胞的關系，Th1和Th2細胞相關細胞因子在哮喘發(fā)病中的作用，從遺傳學和免疫學角度分析哮喘的發(fā)病機制，為尋找抑制氣道嗜酸性

13、粒細胞性炎癥的藥物、免疫學療法及基因治療靶點提供理論和初步實驗依據(jù)。
　　 三.材料與方法
　　 1、研究對象及分組
　　 (1)哮喘組:2010年4月到2011年8月于本院門診隨診的30例哮喘患兒（臨床緩解期），男15例，女15例;年齡2-12歲，平均4.3±2.1歲。均符合2008年中華醫(yī)學會兒科學會呼吸學組制定的兒童支氣管哮喘診斷標準。
　　 (2)對照組:2010年4月到2011年8月于本院健康體

14、檢兒童30例，男16例，女14例;年齡2-12歲，平均4.5±2.3歲。均無過敏性疾病病史。
　　 (3)兩組兒童入組前一周均無使用激素及急性感染病史。組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義。兩組家長均知情同意參加該項研究。
　　 2、標本采集
　　 哮喘組及對照組兒童均于清晨空腹留取外周靜脈血3ml，其中1ml提取全基因組DNA，-20℃冰箱凍存?zhèn)錂z;其余做血涂片后制備血清，室溫(20～25℃)放置60min，200

15、0r/min離心10min，留取血清-70℃冰箱凍存?zhèn)錂z。
　　 3、應用DNA測序法檢測PTEN基因第5、第8外顯子的基因序列
　　 (1)采用苯酚/氯仿提取法提取全基因組DNA。
　　 (2)設計PTEN基因exon-8及exon-5特異引物。
　　 (3)應用PCR技術擴增目的基因。
　　 (4)應用DNA測序儀對哮喘組和對照組標本均進行PTEN基因測序。
　　 (5)利用DNASI

16、S MAX V3.0軟件對DNA序列測定結(jié)果進行分析。
　　 4、細胞因子檢測:
　　 采用ELISA法測定哮喘組及對照組血清標本IL-4、IL-5、IFN-γ。
　　 5、嗜酸粒細胞計數(shù):
　　 將哮喘組及對照組外周血涂片在細胞計數(shù)板上于400倍高倍鏡下進行EOS計數(shù)。
　　 6、數(shù)據(jù)分析
　　 檢測結(jié)果以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，計數(shù)資料采用t檢驗及Wilcoxon秩和檢驗，用S

17、PSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05作為差異有顯著意義的檢驗標準。
　　 四.結(jié)果
　　 1、PTEN基因exon-8及exon-5突變分析
　　 哮喘組和對照組PTEN基因第5外顯子和第8外顯子均未發(fā)現(xiàn)基因突變。
　　 哮喘組PTEN基因第8內(nèi)含子的第32個堿基發(fā)生突變T→G，突變率為86.7％(26/30)。對照組未發(fā)現(xiàn)基因突變。
　　 2、外周血涂片嗜酸粒細胞計數(shù)結(jié)果
　

18、　 哮喘組外周血嗜酸粒細胞計數(shù)420±126（×106/L）顯著高于對照組165±74(×106/L)，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.538，P＜0.001)。
　　 哮喘患兒中，根據(jù)有無發(fā)生PTEN基因第8內(nèi)含子突變，分為基因突變組（男性12例，女性14例，平均年齡4.2±1.5歲）和基因正常組（男性3例，女性1例，平均年齡5.3±4.7歲），PTEN基因發(fā)生突變的哮喘患兒外周血嗜酸粒細胞計數(shù)高于無突變的哮喘兒童，差異有統(tǒng)計學意

19、義(W=25.500，P=0.026)。
　　 3、血清細胞因子IL-4、IL-5和IFN-γ水平檢測結(jié)果
　　 哮喘組與對照組比較，IL.-4水平158.23±28.76(ng/L)高于對照組70.16±15.35(ng/L)，差異有統(tǒng)計學意義(t=14.794，P＜0.001)。
　　 哮喘組與對照組比較，IL-5水平45.32±12.15(ng/L)高于對照組27.58±7.34(ng/L)，差異有統(tǒng)計學意

20、義(t=6.842，P＜0.001)。
　　 哮喘組與對照組比較，IFN-γ水平32.21±6.25(ng/L)低于正常對照組53.65±13.19(ng/L)，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.047，P＜0.001)。
　　 五.結(jié)論
　　 本課題通過基因測序、外周血細胞計數(shù)及血清細胞因子檢測等技術，研究了PTEN基因突變與兒童支氣管哮喘的相關性，其與嗜酸性粒細胞數(shù)量的關系，以及IL-4、IL-5、IFN-γ在哮喘發(fā)

21、病中的作用。通過研究我們得到以下結(jié)論:
　　 1、哮喘兒童的PTEN基因第8外顯子無基因突變，但第8內(nèi)含子存在具有顯著意義的點突變:第32個堿基突變(T→G)，突變率高達86.7％;
　　 2、哮喘組兒童外周血嗜酸粒細胞計數(shù)明顯升高;
　　 3、PTEN基因發(fā)生突變的哮喘患兒外周血嗜酸粒細胞計數(shù)高于無突變的哮喘兒童;
　　 4、哮喘兒童PTEN基因第5外顯子未發(fā)現(xiàn)突變;
　　 5、哮喘兒童存在Th