神經(jīng)橋接導(dǎo)管內(nèi)GDNF緩釋微囊對(duì)大鼠面神經(jīng)的誘向再生作用.pdf

1、面神經(jīng)是周?chē)窠?jīng)中重要的一支，支配人的面部表情，在外傷、手術(shù)、炎癥或腫瘤等情況下較易受到損傷，損傷后雖然可通過(guò)外科手術(shù)將其修復(fù)，但面部運(yùn)動(dòng)功能卻常常難以完全恢復(fù)正常，術(shù)后容易產(chǎn)生聯(lián)帶運(yùn)動(dòng)、半面痙攣等面癱后遺癥，直接或間接地影響了患者的生活質(zhì)量。
　　 體外研究表明各種外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能誘導(dǎo)再生軸突的生長(zhǎng)方向，并證實(shí)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)方向趨向于高濃度梯度的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子方向。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)是目前所發(fā)現(xiàn)的對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)

2、作用最強(qiáng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。研究中發(fā)現(xiàn)面神經(jīng)軸突的錯(cuò)向再生與膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子濃度呈濃度依賴(lài)性關(guān)系，一定濃度的GDNF對(duì)周?chē)窠?jīng)有明顯的減少錯(cuò)向再生的作用。
　　 在面神經(jīng)損傷后修復(fù)過(guò)程中，人工生物導(dǎo)管因其供體來(lái)源廣泛、無(wú)免疫反應(yīng)、減少周?chē)M織疤痕侵入、生長(zhǎng)導(dǎo)向性好、隨意塑形、可以添加多種活性物質(zhì)等受到越來(lái)越多的重視。其修復(fù)的神經(jīng)缺損距離長(zhǎng)，效果接近自體神經(jīng)移植。但如何將外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子導(dǎo)入神經(jīng)導(dǎo)管，以更有效的時(shí)間和空間特異

3、性方式釋放活性分子，一直是生物學(xué)家和工程專(zhuān)家共同努力的方向。
　　 本研究通過(guò)將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF微囊化，建立不同濃度的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘向作用評(píng)估體系，并將GDNF通過(guò)微囊的形式在神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)緩釋?zhuān)瑖L試在時(shí)間和空間上尋找一種更有效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子釋放方式，評(píng)估其對(duì)面神經(jīng)錯(cuò)向再生的修復(fù)效果。本研究共分為三個(gè)部分。
　　 第一部分，GDNF緩釋微囊的制備及其特性的測(cè)定
　　 目的：制備目的GDNF緩釋微囊并對(duì)其特性進(jìn)行測(cè)

4、定。方法：復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備GDNF緩釋微囊，采用60Co放射源對(duì)凍干微囊進(jìn)行輻照滅菌。通過(guò)細(xì)菌學(xué)檢查評(píng)價(jià)微囊滅菌效果，光鏡、電鏡對(duì)微囊的形態(tài)和分布進(jìn)行評(píng)估，計(jì)算微囊的各物理性狀，GDNF-ELISA測(cè)定其體外釋放，細(xì)胞培養(yǎng)評(píng)估其生物學(xué)活性。結(jié)果：制備并輻射滅菌后的微囊，培養(yǎng)7天無(wú)微生物生長(zhǎng)，滅菌微囊符合無(wú)菌規(guī)定。掃描電鏡下見(jiàn)微囊形態(tài)完整，表面光滑。測(cè)得微囊粒徑大小為19.15±0.23um。GDNF緩釋微囊的產(chǎn)率為79.10％，微囊的

5、載藥量為0.175ug/mg，包裹率為69.6％。體外釋放實(shí)驗(yàn)示GDNF緩釋微囊前3天釋放藥物總量的1/3，3天后藥物的釋放趨于穩(wěn)定，40天內(nèi)絕大多數(shù)藥物從微囊相對(duì)穩(wěn)定的釋放出來(lái)。微囊內(nèi)GDNF生物學(xué)活性的測(cè)定結(jié)果示陽(yáng)性對(duì)照組中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突起的數(shù)量及長(zhǎng)度與GDNF微囊組無(wú)明顯差別(P>0.05)，均優(yōu)于空白對(duì)照組中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突起的數(shù)量及長(zhǎng)度，證明了制備的GDNF緩釋微囊中的GDNF具有生物活性。結(jié)論：采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法成功制備GDNF緩

6、釋微囊，并采用60Co放射源對(duì)凍干微囊進(jìn)行輻照滅菌。通過(guò)對(duì)微囊特性的研究、無(wú)菌檢查和GDNF活性測(cè)定證明微囊形態(tài)良好，含有目標(biāo)濃度和活性的GDNF，控釋效果理想。
　　 第二部分，GDNF緩釋微囊體外釋放對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元誘向生長(zhǎng)作用的研究
　　 目的：建立神經(jīng)細(xì)胞誘向再生模型，通過(guò)誘向再生模型對(duì)所制作的GDNF緩釋微囊進(jìn)行濃度篩選，以期得到對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元誘向作用最佳的GDNF緩釋微囊濃度。方法：參考Cao等人方案研究建立神經(jīng)細(xì)

7、胞誘向生長(zhǎng)模型，用細(xì)胞培養(yǎng)法鑒定小室中神經(jīng)細(xì)胞活性，GDNF-ELISA檢測(cè)不同分區(qū)瓊脂糖內(nèi)GDNF濃度，以證實(shí)誘向小室內(nèi)濃度梯度的形成；將不同濃度的微囊置于誘向小室中，來(lái)檢測(cè)不同濃度GDNFX寸神經(jīng)細(xì)胞的誘向作用。結(jié)果：在誘向小室內(nèi)形成濃度梯度，成功建立神經(jīng)細(xì)胞誘向生長(zhǎng)模型，誘向小室瓊脂糖無(wú)明顯細(xì)胞毒性，該模型用于神經(jīng)細(xì)胞可行。在不同濃度微囊誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)方面，GDNF200ng/ml組與GDNF100ng/ml組間無(wú)明顯區(qū)別，差

8、異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；GDNF200ng/ml組及GDNF100ng/ml組與空白對(duì)照組及GDNF50ng/ml組間比較，前兩組均明顯優(yōu)于后兩組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組與GDNF50ng/ml組間差異明顯，也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：本部分通過(guò)建立運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元誘向再生模型和利用該模型對(duì)所制作的GDNF緩釋微囊進(jìn)行濃度篩選，初步確立了GDNF的體外對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞誘向作用的最佳濃度為100ng

9、/ml。
　　 第三部分，神經(jīng)橋接導(dǎo)管內(nèi)GDNF緩釋微囊對(duì)大鼠面神經(jīng)誘向再生作用的研究
　　 目的：應(yīng)用含前期制備和篩選的GDNF緩釋微囊的PLGA/殼聚糖復(fù)合的神經(jīng)導(dǎo)管來(lái)橋接大鼠面神經(jīng)總干，探討面神經(jīng)損傷神經(jīng)誘向再生作用更有效的GDNF釋放方式。方法：通過(guò)解剖定位面神經(jīng)主干及各分支走行，用冰凍切片、熒光逆行追蹤法定位面神經(jīng)核在大腦中的位置及各亞核分布區(qū)域。在體研究中以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物面神經(jīng)橋接室內(nèi)注射材料不同分為三組，空白對(duì)照

10、組、GDNF凝膠注射組及GDNF微囊注射組。術(shù)后9周，用面肌功能評(píng)價(jià)、組織學(xué)、錯(cuò)向再生率、肌電圖指標(biāo)等評(píng)價(jià)其面神經(jīng)誘向再生和面肌功能恢復(fù)情況。結(jié)果：明確面神經(jīng)主干及各分支走行，以追蹤面神經(jīng)顴支和頰支來(lái)評(píng)價(jià)面神經(jīng)錯(cuò)向再生率。GDNF微囊組在收縮功能評(píng)分、熒光逆向追蹤計(jì)算錯(cuò)向再生率、肌電圖等方面均優(yōu)于GDNF組及空白對(duì)照組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：在可降解神經(jīng)生物導(dǎo)管內(nèi)加入GDNF緩釋微囊橋接被切斷的成年SD大鼠面神經(jīng)主干