PMAP-36的分子改良及其作用機(jī)理的研究.pdf

1、PMAP-36是來(lái)源于豬骨髓含36個(gè)氨基酸的陽(yáng)離子抗菌肽。本研究以PMAP-36為模板，通過(guò)優(yōu)化相關(guān)結(jié)構(gòu)參數(shù)，如兩親性、結(jié)構(gòu)傾向性等對(duì)其進(jìn)行改良，在此基礎(chǔ)上測(cè)定了改良肽PRW4、PRW4-d和PRW4-R的抗菌活性和作用機(jī)理;篩選出具有特異性抗綠膿桿菌肽T9W，評(píng)估了T9W抗綠膿桿菌效果;基于T9W序列特征，全新設(shè)計(jì)一系列含有七肽重復(fù)序列的抗菌肽，比較了這些肽在抗綠膿桿菌和作用機(jī)制方面的差異。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)非完美兩

2、親性抗菌肽的設(shè)計(jì)。兩親性是影響抗菌肽活性的重要參數(shù)之一。完美兩親性結(jié)構(gòu)通?？梢蕴岣呖咕牡幕钚?，但同時(shí)也會(huì)引起細(xì)胞毒性的增加。通過(guò)分析PMAP-36序列及氨基酸組成，采用序列截短和氨基酸替換方法，設(shè)計(jì)一系列非完美兩親性α-螺旋抗菌肽。首先，截取PMAP-36N端16個(gè)氨基酸序列，命名為RI16。與PMAP-36相比，RI16具有完美的兩親性結(jié)構(gòu)。根據(jù)α-螺旋蛋白折疊原則，利用色氨酸(Trp)替換兩親性結(jié)構(gòu)極性面中的成對(duì)的賴(lài)氨酸(Lys)

3、設(shè)計(jì)了一系列非完美兩親性抗菌肽。結(jié)果表明，具有氫鍵連接的Trp改良肽PRW4具有較強(qiáng)的廣譜抗菌活性，其最小抑菌濃度(MIC)在4-8μM之間，同時(shí)不具有細(xì)胞毒性。PRW4可透化細(xì)菌細(xì)胞外膜和內(nèi)膜，引起膜電勢(shì)發(fā)生改變，破壞細(xì)胞膜完整性。掃描電鏡和透射電鏡觀(guān)測(cè)結(jié)果表明，PRW4引起細(xì)胞膜形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，表明PRW4通過(guò)破壞細(xì)胞膜發(fā)揮抗菌作用。這些結(jié)果表明，適度破壞抗菌肽的兩親性在提高抗菌活性的同時(shí)，能夠降低細(xì)胞毒性。
　

4、　(2)具有不同螺旋傾向性抗菌肽的設(shè)計(jì)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證和研究非完美兩親性抗菌肽的優(yōu)化或設(shè)計(jì)方法，以PRW4為模板，分別利用具有不同螺旋傾向性的氨基酸半胱氨酸(Cys)、天門(mén)冬氨酸(Asp)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)和D-色氨酸(D-Trp)替換PRW4中的Trp。同時(shí)，為了研究精氨酸（Arg）的重要作用，將PRW4中的Lys全部替換成Arg。結(jié)果表明，與PRW4相比，D-Trp取代的抗菌肽PRW4-d比Cys(C4)、Asp

5、(D4)、Ile(I4)和Pro(P4)取代的抗菌肽活性高。而且，Arg取代抗菌肽PRW4-R的抗菌活性和細(xì)胞選擇性進(jìn)一步提高。優(yōu)化的肽序列PRW4-d和PRW4-R通過(guò)引起細(xì)胞膜電勢(shì)能損失，通透性增加，完整性破壞發(fā)揮抗菌作用。這些結(jié)果對(duì)設(shè)計(jì)或優(yōu)化短鏈抗菌肽具有一定的借鑒意義。
　　(3)疏水面完整性對(duì)抗菌肽活性的影響。在兩親性結(jié)構(gòu)中，疏水面的完整性對(duì)抗菌肽的活性具有重要影響。RI16疏水面的中心位置是一個(gè)中性氨基酸蘇氨酸(Thr

6、)，為了研究疏水面完整性對(duì)抗菌肽活性的影響，以RI16為模板，分別利用帶正電荷氨基酸Lys(T9K)、疏水性氨基酸Ile(T9I)，以及芳香族氨基酸Trp(T9W)和苯丙氨酸(Phe)(T9F)替換RI16序列中的Thr。結(jié)果表明，疏水面的完整性與抗菌肽的抗菌活性之間沒(méi)有顯著的相關(guān)關(guān)系。疏水面中心位置的Trp是抗菌肽T9W發(fā)揮抗綠膿桿菌活性的關(guān)鍵。
　　T9W具有較強(qiáng)的抗綠膿桿菌活性，包括臨床和耐藥菌株，其MIC為1-2μM，致死

7、濃度(LC)為1-4μM，表明T9W通過(guò)殺菌機(jī)制發(fā)揮抗綠膿桿菌活性。殺菌動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，T9W在30 min(1×LC)或5min(4×LC)內(nèi)可快速殺死綠膿桿菌，包括耐藥菌株。而且，T9W與抗生素環(huán)丙沙星和慶大霉素具有協(xié)同效應(yīng)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，T9W對(duì)紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均沒(méi)有毒性。細(xì)胞選擇性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，T9W能夠有效地清除細(xì)胞外的綠膿桿菌，而對(duì)細(xì)胞本身沒(méi)有毒性。此外，T9W還具有較強(qiáng)的鹽離子穩(wěn)定性和抗生物被膜（biof

8、ilm）活性。T9W主要是通過(guò)與綠膿桿菌細(xì)胞外膜LPS結(jié)合，聚集在細(xì)胞表面，破壞質(zhì)膜完整性，引起細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，從而達(dá)到殺菌目的。這些結(jié)果表明T9W具有開(kāi)發(fā)成抗綠膿桿菌藥物的潛力。
　　(4)七肽重復(fù)序列抗菌肽的全新設(shè)計(jì)。根據(jù)T9W的序列特征，利用亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、Trp、Phe和Arg，全新設(shè)計(jì)含有七肽重復(fù)序列模型的抗菌肽分子，其序列模型為(abcdefg)n-(W)n-(gfedcba)n（a和d分別為L(zhǎng)eu

9、、Ala、Trp和Phe，b、c、e、f和g為Arg，W為T(mén)rp，n為重復(fù)單位）。結(jié)果表明，a和d位置為L(zhǎng)eu的肽序列具有更強(qiáng)的抗菌活性。七肽重復(fù)序列的延長(zhǎng)誘導(dǎo)肽鏈形成coiled-coil結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，而增加七肽重復(fù)序列之間的Trp影響肽鏈螺旋結(jié)構(gòu)的形成和細(xì)胞選擇性。優(yōu)化的肽序列能夠有效地清除綠膿桿菌biofilm，中和內(nèi)毒素，以及具有較強(qiáng)的鹽離子穩(wěn)定性。此外，這些肽序列能夠引起細(xì)胞膜通透性增加，質(zhì)膜完整性破壞，從而發(fā)揮

10、抗菌活性。
　　本研究以豬源抗菌肽PMAP-36為模板，通過(guò)破壞抗菌肽兩親性的思路設(shè)計(jì)了一系列的α-螺旋抗菌肽，篩選出的抗菌肽PRW4、PRW4-d和PRW4-R具有廣譜抗菌活性;優(yōu)化的抗菌肽T9W具有特異性抗綠膿桿菌活性;設(shè)計(jì)的含有七肽重復(fù)序列的抗菌肽也具有較強(qiáng)的抗綠膿桿菌活性。初步探明篩選出的改良肽是通過(guò)與細(xì)胞膜相互作用發(fā)揮抗菌功能的。這些結(jié)果為研制新型抗菌藥物提供了優(yōu)良的候選抗菌肽，為有效替代或減少抗生素作為飼料添加劑的使用