廣金錢草總黃酮抑制腎草酸鈣結(jié)石形成的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　從中藥廣金錢草中提取、分離得到廣金錢草總黃酮(TFDS)，采取L-羥脯氨酸喂飼誘導(dǎo)建立大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型，觀察TFDS對(duì)大鼠結(jié)石形成及結(jié)石相關(guān)生化指標(biāo)的影響明確療效，通過(guò)檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)探討TFDS抗結(jié)石的可能機(jī)制。
　　方法:
　　采用乙醇對(duì)廣金錢草進(jìn)行回流提取，所提浸膏經(jīng)大孔樹(shù)脂分離及純化，從而得到廣金錢草總黃酮，通過(guò)LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行質(zhì)量控制。采用L-羥脯氨酸(HLP)喂飼

2、法誘導(dǎo)創(chuàng)立一個(gè)關(guān)于大鼠的腎草酸鈣結(jié)石的模型。SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠(180-220g)40只，隨機(jī)分成5組(n=8):空白(Control)組、TFDS對(duì)照組、成石組(HLP)、TFDS低劑量治療組和TFDS高劑量治療組?？瞻捉M隨意獲取正常的鼠糧，蒸餾水飲水;TFDS對(duì)照組在Control組基礎(chǔ)上用灌胃的方法給予TFDS400 mg/kg/d;成石組自由攝取5％ HLP特制鼠糧，蒸餾水飲水;TFDS低劑量治療組在成

3、石組基礎(chǔ)上灌胃給予TFDS100mg/kg/d; TFDS高劑量治療組在成石組基礎(chǔ)上灌胃給予TFDS400mg/kg/d。各組大鼠在相同條件下飼養(yǎng)28天后將大鼠的尿液收集、血液收集及雙腎的標(biāo)本進(jìn)行收集。其中，大鼠尿液用于檢測(cè)尿量、pH值、尿鈣、尿鎂、尿肌酐、尿蛋白、尿結(jié)晶、尿草酸及枸櫞酸;大鼠血液用于生化血CR（肌酐）的檢測(cè)及BUN（血尿素氮）濃度;將左側(cè)腎臟組織制成10％勻漿，測(cè)定其MDA、SOD、CAT和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-

4、Px)含量了解OS情況;右腎組織在顯微鏡下觀察病理學(xué)改變和結(jié)晶沉積情況，免疫組化檢測(cè)骨橋蛋白(OPN)、單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　從廣金錢草中分離出純度為68.34％的TFDS，LC-MS/MS分析初步證實(shí)含有夏佛塔苷、異葒草苷和異牡荊苷等黃酮類單體成分。L-羥脯氨酸(HLP)成功誘導(dǎo)后大鼠尿液中草酸的含量顯著升高，從而引發(fā)腎草酸鈣結(jié)石形成。

5、　　(1)一般及生化指標(biāo):TFDS對(duì)照組和空白組大鼠各參數(shù)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。與空白組比較，成石組大鼠體重變化及攝食量顯著降低(P＜0.01)，腎重量和飲水量則顯著增加（分別P＜0.01，P＜0.05）;尿量顯著增加(P＜0.01)，pH值、尿肌酐、尿蛋白等均顯著下降(P＜0.01);尿鈣、尿鎂顯著降低(分別P＜0.05，P＜0.01)，24h尿草酸顯著增加(P＜0.05)，而24h尿檸檬酸則顯著減少(P＜0.05);尿Ca

6、Ox結(jié)晶顯著增加(P＜0.01)，尿液中可見(jiàn)大量典型的信封樣、六面體CaOx結(jié)晶;血肌酐和尿素氮顯著增加（分別P＜0.01，P＜0.05）。與成石組比較，TFDS高劑量組大鼠體重變化顯著增加(P＜0.05)，同時(shí)腎重量顯著下降(P＜0.05); TFDS低劑量組大鼠飲水量顯著下降(P＜0.05)，但攝食量則顯著增加(P＜0.05); TFDS高劑量組大鼠尿液pH值和尿肌酐均顯著增加(分別P＜0.01，P＜0.05); TFDS低劑量組大

7、鼠尿鈣、尿鎂顯著增加(P＜0.05)，24h尿檸檬酸亦顯著增加(P＜0.05); TFDS高劑量組大鼠24h尿草酸顯著降低(P＜0.01); TFDS低、高劑量組大鼠尿CaOx結(jié)晶顯著減少(P＜0.01); TFDS高劑量組均能降低血肌酐和尿素氮水平(P＜0.05)，其中，TFDS低劑量組還能降低血尿素氮水平(P＜0.05)。
　　(2)腎臟病理分析指標(biāo):
　　空白組和TFDS對(duì)照組腎組織結(jié)構(gòu)整齊，腎小管腔內(nèi)未見(jiàn)結(jié)石形成。成

8、石組大鼠腎組織可見(jiàn)管腔明顯擴(kuò)大，上皮細(xì)胞脫落，間質(zhì)中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，從髓質(zhì)到皮質(zhì)均可見(jiàn)大量草酸鈣結(jié)晶沉積。TFDS治療組腎小管腔內(nèi)亦可見(jiàn)結(jié)晶沉積和管腔擴(kuò)大，但上述改變較成石組減輕。與空白組比較，成石組大鼠腎CaOx結(jié)晶顯著增加(P＜0.01)，TFDS干預(yù)后大鼠尿CaOx結(jié)晶顯著減少，與成石組比較，TFDS低、高劑量組大鼠腎CaOx結(jié)晶顯著減少(P＜0.01)。TFDS對(duì)照組和空白組大鼠比較，MDA、SOD、CAT和GSH-Px等均無(wú)

9、顯著性差異(P＞0.05)。與空白組比較，成石組大鼠MDA顯著增加(P＜0.01)，而CAT和GSH-Px則顯著降低(分別P＜0.01和P＜0.05)。與成石組比較，TFDS低劑量組大鼠MDA顯著減少(P＜0.01)，而GSH-Px則顯著增加(P＜0.01); TFDS高劑量組大鼠MDA也顯著減少(P＜0.01)，而CAT和GSH-Px均顯著增加（分別P＜0.05和P＜0.01)。MCP-1、OPN和TGF-β三種蛋白在空白組和TFDS

10、對(duì)照組均為弱表達(dá)，而成石組三種的蛋白表達(dá)則顯著增強(qiáng)，與成石組相比，使用TFDS進(jìn)行干預(yù)后，TFDS低、高劑量治療組三種蛋白表達(dá)顯著減少，其中以高劑量組為明顯。
　　結(jié)論:
　　大孔吸附樹(shù)脂是廣金錢草總黃酮有效、穩(wěn)定的分離提純方法，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)為TFDS的質(zhì)量控制提供了有力的保障。HLP喂飼法誘導(dǎo)高草酸尿建立草酸鈣結(jié)石模型效果確切，值得推廣。TFDS具有抑制大鼠草酸鈣結(jié)石形成的作用:1）它能夠降低24h尿草酸排泄，增加尿鈣、尿