胸腺內(nèi)注射供體BMSCs對同種異體腹部皮瓣移植排斥反應(yīng)影響的研究.pdf

1、血管化異體復(fù)合組織移植（Vascularized Composite Allotransplantation，VCA）是目前修復(fù)嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除、先天畸形等造成大面積組織缺損的有效手段之一，但術(shù)后通常需要終身服用免疫抑制劑，且急性排斥反應(yīng)發(fā)生率高，需要大劑量激素和免疫抑制劑沖擊治療，所帶來的嚴(yán)重藥物毒副作用限制了其臨床應(yīng)用。因此，如何誘導(dǎo)免疫耐受，從而減少或停用免疫抑制劑，成為VCA在臨床推廣應(yīng)用的突破口。胸腺作為機(jī)體重要的中樞免疫器

2、官，對于自身免疫耐受和移植免疫耐受的誘導(dǎo)和維持具有重要作用，是移植免疫研究干預(yù)的主要靶點(diǎn)之一。已有大量研究發(fā)現(xiàn)胸腺內(nèi)注射供體抗原成分或抗原提呈細(xì)胞能有效誘導(dǎo)受體對異體移植物免疫耐受。有研究發(fā)現(xiàn)，異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow-derived Mesenchymal stem cells，BMSCs）在受體胸腺微環(huán)境中能夠部位特異性分化為胸腺基質(zhì)細(xì)胞，而此類細(xì)胞在機(jī)體胸腺內(nèi)陽性選擇和陰性選擇過程中起著關(guān)鍵作用，參與機(jī)體自身免

3、疫耐受的誘導(dǎo)和維持。因此，將供體BMSCs胸腺內(nèi)注射至受體胸腺，也許能夠使其在受體胸腺微環(huán)境中部位特異性分化為胸腺基質(zhì)細(xì)胞，從而馴化受體T細(xì)胞，有可能誘導(dǎo)移植免疫耐受。
　　目的:
　　體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增供體BN大鼠BMSCs，并將其胸腺內(nèi)注射至受體Lewis大鼠胸腺，聯(lián)合60Coγ射線4Gy全身照射，觀察其對同種異體腹部皮瓣移植物存活時(shí)間的影響。并對移植皮瓣進(jìn)行病理學(xué)檢查，比較各組移植皮瓣排斥反應(yīng)發(fā)生情況。通過流式細(xì)胞術(shù)檢

4、測各組受體調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T Cell，Treg）比例變化，并取受體脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（Mixed Lymphocyte Reaction，MLR），比較各組受體淋巴細(xì)胞對供體抗原的反應(yīng)性，以初步探討其對移植排斥反應(yīng)影響的機(jī)制。
　　方法:
　　全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離BN大鼠BMSCs并嚴(yán)格控制換液和消化時(shí)間以對其進(jìn)行純化、擴(kuò)增。取所培養(yǎng)的P3代細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)對其表型進(jìn)行鑒定及誘導(dǎo)成

5、脂、成骨能力鑒定。受體Lewis大鼠隨機(jī)分為A組(空白對照組)、B組(BMSCs組)、C組(60Coγ射線4Gy全身照射組)、D組(4Gy全身照射+BMSCs組)。各組大鼠第0天進(jìn)行同種異體腹部皮瓣移植，A組移植前14天胸腺內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS），B組移植前14天胸腺內(nèi)注射供體BMSCs，C組移植前15天給予60Coγ射線4Gy全身照射，移植前14天胸腺內(nèi)注射PBS，D組除移植前

6、15天4Gy全身照射外，移植前14天胸腺內(nèi)注射供體 BMSCs。移植后大體觀察比較移植皮瓣存活情況并繪制生存曲線；移植后第7天取移植皮瓣進(jìn)行病理學(xué)檢查；排斥終點(diǎn)流式檢測脾臟Treg比例變化，并采用體外單向MLR檢測受體脾淋巴細(xì)胞對供體抗原反應(yīng)性變化。
　　結(jié)果:
　　全骨髓貼壁培養(yǎng)法能夠成功分離培養(yǎng)和擴(kuò)增出大量 BMSCs，其 P3代流式細(xì)胞術(shù)表型鑒定結(jié)果為CD29、CD44、CD90陽性，而CD11b/c、CD34、CD4

7、5陰性，經(jīng)成脂、成骨誘導(dǎo)后可分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞。B組的移植皮瓣存活時(shí)間與A組相比無明顯差異(P＞0.05)，而D組的移植皮瓣平均存活時(shí)間較C組平均延長3.4天，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，脾細(xì)胞Treg比例顯著增高(P＜0.01)，脾淋巴細(xì)胞對供體抗原反應(yīng)性顯著降低(P＜0.05)。且移植皮瓣病理學(xué)檢查表明D組與其他三組相比，其皮瓣內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤較少，皮膚結(jié)構(gòu)較完整，排斥反應(yīng)較輕。
　　結(jié)論:
　　全骨髓貼壁培養(yǎng)