卵巢癌紫杉醇耐藥相關(guān)蛋白的比較蛋白質(zhì)組分析及耐藥表達(dá)候選蛋白cofilin1的研究.pdf

1、研究背景和目的：卵巢癌是婦科惡性腫瘤中發(fā)病率占第三位，死亡率占第一位的惡性疾患。在滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上輔助紫杉醇+順鉑為主聯(lián)合化療的治療策略雖然明顯改善了初治卵巢癌的預(yù)后，但是晚期卵巢癌的5年生存率仍然徘徊在15-20％左右?；熀竽[瘤原發(fā)或獲得性對化療藥物廣泛的交叉耐藥是治療失敗的主要原因之一。目前對腫瘤耐藥機(jī)制的認(rèn)識已經(jīng)相對深入，但是究其對于臨床的指導(dǎo)意義和應(yīng)用價(jià)值卻十分有限。已知的相關(guān)耐藥基因在卵巢癌中的表達(dá)不能良好地預(yù)測

2、腫瘤的耐藥性和預(yù)后，有關(guān)腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究在體內(nèi)也未達(dá)到理想效果。這說明尚有許多未知的耐藥機(jī)制有待發(fā)現(xiàn)，耐藥基因的表達(dá)和相應(yīng)表達(dá)蛋白的功能之間可能存在差異。 蛋白質(zhì)組學(xué)是1994年才提出并發(fā)展的一項(xiàng)新興學(xué)科。它著眼于從生命功能的執(zhí)行體-蛋白質(zhì)水平研究基因的表達(dá)和功能，采用高通量，高分辨率，高效率的蛋白質(zhì)分離和鑒定技術(shù)，試圖從機(jī)體或細(xì)胞的整體水平上認(rèn)識生物體蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾、結(jié)構(gòu)及功能，以期反映機(jī)體內(nèi)代謝動態(tài)變化的過程。蛋白質(zhì)

3、組學(xué)技術(shù)用于腫瘤的生物學(xué)研究，與基因組學(xué)研究相比，其最大的優(yōu)勢在于，能夠動態(tài)反映腫瘤發(fā)生發(fā)展各個(gè)不同時(shí)期蛋白質(zhì)種類和數(shù)量變化，同時(shí)找出多個(gè)與腫瘤基因表達(dá)和功能相關(guān)的蛋白群，為探討腫瘤發(fā)生機(jī)制，尋找腫瘤診斷和預(yù)后特異標(biāo)記物提供了極大的可能。 本研究在認(rèn)識腫瘤耐藥相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，以卵巢上皮癌一線化療藥物紫杉醇為研究對象，全面觀察耐藥基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)狀況。通過體外不同給藥方式誘導(dǎo)卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株，采用雙向電泳技術(shù)(2-D

4、E)，制備紫杉醇化療敏感和耐藥細(xì)胞株的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找差異表達(dá)蛋白；篩選和獲得高豐度的耐藥標(biāo)記物候選蛋白，并在臨床標(biāo)本中驗(yàn)證候選耐藥標(biāo)記物。 研究內(nèi)容： 1.選擇卵巢癌化療敏感細(xì)胞株SKOV3，分別采用小劑量濃度遞增間歇誘導(dǎo)和大劑量沖擊誘導(dǎo)法誘導(dǎo)耐藥的SKOV3細(xì)胞株SK-TR30，SK-TR2500。獲購卵巢癌化療敏感細(xì)胞株A2780，紫杉醇耐藥細(xì)胞株A2780-TR。檢測耐藥細(xì)胞株SK-TR3

5、0，SK-TR2500和A2780-TR的耐藥指數(shù)和生物學(xué)特性；RT-PCR和Westernblot觀察化療敏感和耐藥細(xì)胞中的紫杉醇耐藥相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)。 2.采用2-DE，制備卵巢癌化療敏感細(xì)胞株SKOV3、A2780和卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，通過比較蛋白質(zhì)組分析，尋找高豐度表達(dá)的差異候選蛋白。 3.選取紫杉醇耐藥相關(guān)的差異候選蛋白cofil

6、in1，采用分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)，分別構(gòu)建含有cofilin1cDNA正義序列和反義序列的重組載體pcDNA-cof和pcDNA-antisense-cof的質(zhì)粒，經(jīng)過細(xì)胞轉(zhuǎn)染，對其耐藥功能進(jìn)行檢測。 4.收集臨床已經(jīng)證實(shí)的24例化療敏感患者及22例耐藥患者的卵巢癌組織，采用免疫組織化學(xué)的方法觀察cofilin1和磷酸化cofilin1的表達(dá)，并比較化療敏感和耐藥者上述兩種蛋白的含量是否存在顯著性差異。 結(jié)論：

7、 1.采用大劑量沖擊誘導(dǎo)法建立的紫杉醇耐藥細(xì)胞株SK-TR2500的耐藥指數(shù)低于小劑量誘導(dǎo)法建立的紫杉醇耐藥細(xì)胞株SK-TR30，但其耐藥誘導(dǎo)過程與臨床化療過程接近，從而為研究紫杉醇耐藥機(jī)制建立了一種良好的體外模型。 2.通過2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS的比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)共篩選出SKOV3，A2780紫杉醇耐藥細(xì)胞株16個(gè)耐藥相關(guān)標(biāo)記候選蛋白，這些蛋白與細(xì)胞骨架，氧化反應(yīng)，細(xì)胞代謝，調(diào)亡和蛋白質(zhì)合成，轉(zhuǎn)運(yùn)等細(xì)胞生