甘藍(lán)型油菜菌核病抗性相關(guān)基因BnPTP1與控制開花時間相關(guān)基因BnVRN2的功能研究.pdf

1、油菜是世界四大油料作物之一，菜油是國產(chǎn)食用植物油的第一大來源。然而核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病嚴(yán)重制約著我國油菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。利用油菜抗病品種是菌核病綜合防治的基礎(chǔ)，培育更抗品種是育種的主要目標(biāo)之一。然而，在油菜育種中發(fā)現(xiàn)菌核病的發(fā)生和開花時間具有一定的關(guān)聯(lián):開花較早的品種，菌核病病害更加嚴(yán)重，這給目前正在實施的早熟育種增加了困難。為了提高油菜育種效率，需要闡明油菜菌核病抗性與開花時間之間是否

2、具有遺傳關(guān)系。本實驗室前期以甘藍(lán)型油菜888-5（感病、早花、矮稈、多分枝）和M083（抗病、晚花、高稈、少分枝）雜交形成的重組自交系(RILs)群體為材料，利用油菜60K SNP芯片（Illumina Inc，San Diego，CA）對群體進(jìn)行基因型分型，通過多年多點的表型鑒定，進(jìn)行了全基因組的QTL定位，獲得了一些與抗菌核病及開花相關(guān)的QTL區(qū)間。在這些區(qū)間預(yù)測到若干候選基因。在此基礎(chǔ)上，本研究挑選出兩個候選基因BnPTP1和Bn

3、VRN2，進(jìn)行功能研究，包括BnPTP1和BnVRN2及其所屬基因家族的生物信息分析，在抗、感品系間的差異分析，突變體和過表達(dá)研究。主要結(jié)果如下:
　　1.對BnPTP1的研究
　　1.1 BnPTP1及其所屬基因家族的生物信息分析
　　對BnP TP1的蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)它屬于酪氨酸磷酸酶(PTP)家族。利用擬南芥及蕓薹屬白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜的基因組數(shù)據(jù)，對PTP家族進(jìn)行鑒定和進(jìn)化分析。結(jié)果表明，四個物種中共有19個

4、PTP基因家族成員，可以分為2類，這些基因啟動子區(qū)域富含ABRE、LTRE、MYB、MYC和W-box等順式作用元件，這些順式作用元件跟抗逆抗病應(yīng)答相關(guān)，因此，PTP家族的基因可能參與植物的逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)。
　　1.2 BnPTP1在抗、感親本中的差異分析
　　以甘藍(lán)型油菜M083（抗病、晚花）和888-5（感病、早花）品系為材料對BnPTP1基因進(jìn)行克隆;對兩個品系中BnPTP1序列差異及核盤菌誘導(dǎo)前后的表達(dá)水平差異進(jìn)行

5、分析研究。結(jié)果顯示在甘藍(lán)型油菜中BnPTP1基因存在兩個拷貝，分別命名為BnPTP1a（位于C6染色體）、BnPTP1b（位于A7染色體）。BnPTP1a在抗、感品系中存在序列差異，而BnPTP1b則不存在。BnPTP1a在M083和888-5中的CDS全長分別為1014bp、1017 bp，分別編碼337、338個氨基酸;兩個品系中BnPTP1a基因的CDS序列存在著29個SNP變異位點以及一個3bp的插入/缺失片段(其中M083第6

6、04位(G)對應(yīng)的888-5第607位(T)的核苷酸變異類型與前期的SNP分型結(jié)果一致）;核苷酸序列的差異導(dǎo)致了兩條序列產(chǎn)生了3個各自特異的酶切位點（SpeⅠ、BsmBⅠ、Psp1406Ⅰ和DrdⅠ、EcoRⅠ、BsaⅠ），此外蛋白質(zhì)序列也產(chǎn)生了11個氨基酸的改變，且這些變異的氨基酸都包含在兩者的PTPc結(jié)構(gòu)域中。BnPTP1a基因在菌核病誘導(dǎo)前后，在M083和888-5中的表達(dá)水平都存在差異，因此BnPTP1a參與了菌核病防御反應(yīng)過程

7、。同時進(jìn)行了各自的過表達(dá)載體的構(gòu)建，并成功的篩選到了擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性植株。
　　1.3 ptp1突變體菌核病抗性鑒定
　　由于PTP家族的基因啟動子區(qū)域富含脅迫應(yīng)答相關(guān)順式作用元件，我們進(jìn)一步調(diào)查了野生型擬南芥和ptp1突變體對菌核病的抗性。結(jié)果表明，ptp1突變體的病斑面積表顯著小于WT，即AtPTP1負(fù)調(diào)控植株對菌核病的抗性。此外，分析了ptP1突變體和WT中SA、JA和ROS/PCD信號途徑PR1、PDF1.2、MPK

8、4、MPK6這幾個關(guān)鍵基因的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)AtPTP1基因可能通過抑制SA、JA防御途徑中下游PR1、PDF1.2、MPK4基因的表達(dá)而對SA、JA途徑進(jìn)行負(fù)調(diào)控;AtPTP1基因?qū)OS/PCD途徑中的MPK6基因的作用不明顯，這可能跟突變體在接種核盤菌后產(chǎn)生了大量的活性氧相關(guān)。
　　2.對Bn VRN2的研究
　　2.1 BnVRN2及其所屬基因家族的生物信息分析
　　對BnVRN2蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)它屬于VEF

9、S家族。利用擬南芥及蕓薹屬白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜的基因組數(shù)據(jù)，對VEFS家族進(jìn)行鑒定和進(jìn)化分析。結(jié)果表明，四個物種中共有32個PTP基因家族成員，可以分為2類，這些基因啟動子區(qū)域富含ABRE、LTRE、MYB、MYC和W-box等抗逆抗病應(yīng)答相關(guān)順式作用元件，因此，VRN2基因不僅參與開花調(diào)控也可能參與植物的逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)。
　　2.2 Bn VRN2在抗、感親本中的差異分析
　　在擬南芥中，VRN2(VERNALIZAT

10、ION PESSPONSE2)是春化作用相關(guān)的基因。以M083和888-5為材料對BnVRN2基因進(jìn)行克隆;對兩個品系中BnVRN2序列差異及核盤菌誘導(dǎo)前后的表達(dá)水平差異進(jìn)行研究。結(jié)果顯示在甘藍(lán)型油菜中BnVRN2基因存在兩個拷貝，分別命名為BnVRN2a(位于A8染色體)、BnVRN2b(位于C8染色體)，BnVRN2a在抗、感品系中存在序列差異，而BnVRN2b則不存在。BnVRN2a在M083和888-5中的CDS全長分別為127

11、8bp、1284 bp，分別編碼425、427個氨基酸;兩個品系中BnVRN2a基因的CDS序列存在著12個SNP變異位點以及一個6bp的插入/缺失片段(其中M083第258位(G)對應(yīng)的888-5第258位(T)的核苷酸變異類型與前期的SNP分型結(jié)果一致）;核苷酸序列的差異導(dǎo)致了兩條序列產(chǎn)生了各自特異的酶切位點(XmnⅠ和BspHⅠ);此外蛋白質(zhì)序列也產(chǎn)生了7個氨基酸的改變，且第100位氨基酸變異存在于兩者的鋅指結(jié)構(gòu)中。BnVRN2a