中藥蘇木和新合成的化學(xué)藥對血源性細(xì)胞的誘導(dǎo)作用研究.pdf

1、由于工業(yè)化生產(chǎn)造成的環(huán)境污染、人類生活習(xí)慣等因素，各種腫瘤發(fā)生率逐年增加。為了尋找低毒、高效的抗癌藥，本文研究了中藥蘇木和化學(xué)合成新藥對來源于臍帶血的正常干、祖細(xì)胞和血源性的癌細(xì)胞的正負(fù)調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步探討其作用于靶細(xì)胞的可能機(jī)理，并篩選各種生物活性成分的有效濃度如IC50，為臨床治療各種腫瘤及輔助性治療方法提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、納米技術(shù)及免疫標(biāo)記技術(shù)，通過激光共聚焦顯微鏡、透射電子顯微鏡、

2、掃描電鏡、熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡和PCR儀、酶標(biāo)儀等實(shí)驗(yàn)儀器，研究傳統(tǒng)活血化瘀的中藥蘇木水提物為對來源于臍帶血的單個(gè)核細(xì)胞向粒系、B系和淋巴系方向分化的正向調(diào)節(jié)作用和對髓系白血病細(xì)胞系(K562細(xì)胞)的負(fù)向調(diào)節(jié)作用；使用近年出現(xiàn)的新劑型-脂質(zhì)體包裹蘇木水提物，來探討細(xì)胞內(nèi)給藥的新方法；同時(shí)還通過MTT法對200多種化學(xué)合成新藥進(jìn)行活性篩選，研究它們對K562細(xì)胞的負(fù)調(diào)節(jié)作用。 研究結(jié)果：1.蘇木水提物可以明顯的抑制K562細(xì)胞的

3、增殖，各實(shí)驗(yàn)組與空白對照組相比均有差異(P<0.05)，且抑制率與蘇木水提物濃度成顯著的相關(guān)性(在24h、48h、72h時(shí)r分別為0.90001004、0.984114411和0.973074678)；在48h、100μg/ml時(shí)的作用效果最為明顯；當(dāng)終濃度為25μg/ml時(shí)，對細(xì)胞增殖的抑制作用與5-Fu(50μg/ml)相當(dāng)；蘇木脂質(zhì)體能明顯抑制K562細(xì)胞的集落形成(與對照組相比*P<0.05)，集落形成數(shù)與藥物濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r

4、=0.978)；ID50為129.92μg/ml； 2.蘇木脂質(zhì)體具有誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的作用：熒光顯微鏡(熒光染色)、普通光學(xué)顯微鏡(瑞氏染色)、共聚焦成像、透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核固縮、核碎裂、膜起泡、凋亡小體等各種典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)的形成，且瑞氏染色和熒光染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，相關(guān)性顯著(抑制率與濃度和作用時(shí)間之間均有0.9

5、 ladder電泳條帶；流式細(xì)胞儀檢測出實(shí)驗(yàn)組有高于對照組5倍的凋亡峰(18.6％：3.1％)；3.RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明蘇木脂質(zhì)體誘導(dǎo)凋亡基因p53、Caspase-3、Rb，細(xì)胞周期的調(diào)控基因p16，以及具有雙向調(diào)節(jié)作用的特殊基因Bcl-2基因的高表達(dá)； 3.原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡檢測自制的磁性熒光納米材料(IFN)平均粒徑為122nm；體外毒性實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為對K562、Hela細(xì)胞和小鼠原代骨髓細(xì)胞的增殖沒有明顯的抑制作用

6、(p>0.05)；5.蘇木水提物可誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞向粒一單祖細(xì)胞(CD33)方向分化：靶細(xì)胞在體外培養(yǎng)的7d時(shí)，最佳濃度為25μg/ml；靶細(xì)胞在體外培養(yǎng)的2.5d、3.5d時(shí)，最佳濃度為50μg/ml；在2.5d、3.5d時(shí)，細(xì)胞陽性率與藥物濃度呈正相關(guān)(r=0.9663、0.715526)：6.蘇木水提物可誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞向B系方向分化：靶細(xì)胞在體外培養(yǎng)2.5d、3.5d后，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比有差異(p<0.05)，陽性率均高

7、于70％；在培養(yǎng)時(shí)間延長到7d，CD19+細(xì)胞數(shù)量趨于平緩：50μg/ml處，達(dá)到峰值，接近30％；7.蘇木水提物可誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞向淋巴系方向分化：靶細(xì)胞在體外培養(yǎng)培養(yǎng)后，在37.5μg/ml的誘導(dǎo)下，2.5d、3.5d時(shí)分別到最高點(diǎn)，約88％和92％；CD4的陽性率與藥物濃度之間成顯著正相關(guān)(r2.5d=0.9818665，r3.5d=0.8355519)；8.蘇木水提物可誘導(dǎo)造血干細(xì)胞(CD117+細(xì)胞)向T淋巴細(xì)胞(CD4)分

8、化。其峰值為37.5μg/ml，且CD4陽性率隨蘇木濃度的增加而升高(r=0.910386)；9.MTT法對200多種新合成的化學(xué)藥進(jìn)行抗癌活性篩選，發(fā)現(xiàn)其中54多種化合物對K562細(xì)胞有明顯地抑制作用，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比有差異(p<0.05)，藥物濃度與抑制率之間成正相關(guān)(0.9

9、對照5倍的凋亡細(xì)胞的亞二倍體(18.6％:3.1％)，同時(shí)流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期分析表明K562細(xì)胞停留在G0-G1期。 結(jié)論：1.蘇木水提物對來源于髓系白血病細(xì)胞系K562具有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，其作用機(jī)理可能通過影響相關(guān)基因(p53基因、bcl-2基因、p16基因、Caspase基因和Rb基因)的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)其抗癌活性。2.蘇木水提物具有誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞向粒一單祖細(xì)胞和成熟免疫細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)為靶細(xì)胞表面膜的分