人腦瘤裸小鼠原位移植模型的親本性探索.pdf

1、目的： （1）通過改良腫瘤組織移植的方法以獲得良好的人腦膠質瘤裸小鼠腦內移植模型。在此基礎上，去建立人腦多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiform，GBM）和人肺腺癌腦轉移瘤的裸小鼠模型，并探知其生物學特性能否保持其親本腫瘤的特性。 （2）培育表達綠色熒光蛋白（green fluoresent protein，GFP）的裸小鼠，將其用于人膠質瘤干細胞（human glioma stem cells，

2、HGSCs）移植實驗研究，并闡明HGSCs在宿主腦組織中具有播散和融合其它細胞的特征，以用于腫瘤組織重構的研究。 方法： （1）先用SHG—44膠質瘤細胞（1×107）注射于裸小鼠皮下，形成皮下移植瘤，再把皮下移植瘤組織通過自制的組織擠壓裝置放入24#無菌套管針，并調整腫瘤的體積為2.0mm3，然后把定量要移植的腫瘤組織塊植入裸小鼠右尾狀核，制作成裸小鼠腦內移植瘤模型。觀察移植后裸小鼠生存狀態(tài)。30d后解剖裸小鼠取腦并行

3、病理切片，觀察原位移植瘤的形態(tài)、病理學特征和成瘤率。 （2）將體外培養(yǎng)高表達表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的人腦GBM細胞，在立體定向儀輔助下行裸小鼠右尾狀核接種；繼而將致瘤的組織通過自制的組織擠壓裝置放入24#無菌套管針，然后將2.0mm3的腫瘤組織經徒手操作接種子裸小鼠右尾狀核，致瘤后即用裸小鼠的瘤組織再進行原位傳代接種。接種后觀察移植瘤的生長特性，并分析EGF

4、R在各代移植瘤中的表達。 （3）取人肺腺癌腦轉移瘤組織塊，通過自制的組織擠壓裝置放入24#無菌套管針，然后將2.0mm3的腫瘤組織經徒手操作接種于裸小鼠右尾狀核。致瘤后即用裸小鼠的瘤組織再進行原位傳代接種，然后觀察致瘤率及荷瘤鼠生存期；HE染色分析各代移植瘤的組織學形態(tài)；MRI觀察移植瘤在鼠腦內的大體形態(tài)；免疫組化染色觀察移植瘤中CEA的表達；Alcian blue/PAS特殊染色檢測移植瘤中粘液的性質。 （4）將C57

5、BL/6J—GFP轉基因小鼠與NC系裸小鼠進行交配，在繼代時嚴格挑選都表達GFP的無毛雄鼠（♂）與有毛雌鼠（♀）交配，通過肉眼和熒光顯微鏡等方法觀察GFP在裸小鼠皮膚和臟器中的表達情況，繼將HGSCs原位移植于表達GFP的裸小鼠，以觀察移植瘤的生長情況。 結果： （1）通過改良的腫瘤組織塊移植后，18只裸小鼠除3只接種當日死亡外，其余15只于移植后30d被處死取腦行冰凍切片，HE染色在光鏡下見移植瘤侵襲性生長。致瘤率為9

6、3%（14/15）。 （2）人GBM移植瘤組織在裸小鼠尾狀核已連續(xù)傳至13代，共130只鼠，荷瘤鼠生存期為19±1.33d。移植瘤病理學符合呈高度侵襲性生長、EGFR過表達的人腦GBM的特征。不同時間測得的腫瘤增殖曲線提示，致瘤的潛伏期短（<3d），持續(xù)快速增殖期長（>15d），進入晚期至死亡時間短（<3d）。 （3）人肺腺癌腦轉移瘤組織在裸小鼠右尾狀核已連續(xù)傳至6代，共65只鼠。荷瘤鼠生存期：原代為47.6±1.8d，

7、2—3代有所縮短，4—6代穩(wěn)定在38.0±0.9d；移植瘤病理為低分化腺癌，不向周圍正常鼠腦組織侵襲；MRI示移植瘤類圓形，瘤周無水腫，與臨床病例的MRI一致；移植瘤中癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）表達陽性，并有酸性粘液存在。 （4）GFP熒光裸小鼠已傳至8代，包括腦在內的全身主要器官和細胞都發(fā)綠色熒光。對用于HGSCs原位移植的腦，能清晰辨認出不發(fā)光的瘤細胞和發(fā)光的宿主細胞。而瘤細胞經抗人

8、類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）—Ⅰ抗體偶聯(lián)紅色熒光劑（PE）的免疫組織化學染色后，在共聚焦顯微鏡下可清晰顯示HGSCs與宿主腦細胞的組織學關系是：多數(shù)播散，個別的發(fā)生細胞與細胞融合。 結論： （1）通過改良的組織定量移植具有操作簡便，對小鼠創(chuàng)傷小，速度快，成瘤率高，便于批量制作原位移植裸小鼠模型。 （2）人GBM腫瘤組織于鼠尾狀核接種比傳統(tǒng)的腫瘤細胞懸液接種，非但接種的細胞

9、量大，還能將支持腫瘤細胞增殖的間質等其它成分一并植入，能較好體現(xiàn)臨床上呈侵襲生長和過表達EGFR的高度惡性膠質瘤的特征。 （3）人肺腺癌腦轉移瘤組織塊接種于鼠腦內建立的原位移植模型能更好地模擬臨床原發(fā)腫瘤呈現(xiàn)低分化的病理學特征，并且具有缺乏侵襲性及CEA高表達的生物學特性，說明本方法為研究人肺腺癌腦轉移瘤的生物學特性及實驗治療提供了一個可靠的動物模型。 （4）用免疫功能健全、表達GFP的轉基因鼠與免疫功能缺陷的裸小鼠雜交，可