消痰散結(jié)方對(duì)裸鼠原位移植人胃癌轉(zhuǎn)移及相關(guān)粘附分子的影響.pdf

1、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的特征之一，也是導(dǎo)致胃癌死亡率居高不下的重要原因。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程包括腫瘤新生血管生成，腫瘤細(xì)胞從原位脫落，進(jìn)入血液循環(huán)，與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用并在異位器官生長(zhǎng)等。細(xì)胞粘附在其中發(fā)揮極其重要的作用。魏品康教授在多年胃癌臨床治療中提出“消痰散結(jié)”法則，設(shè)立消痰散結(jié)方應(yīng)用于胃癌的中西結(jié)合治療，已取得了令人滿意的療效。前期的研究中發(fā)現(xiàn)，消痰散結(jié)方可以影響腫瘤細(xì)胞CD44、ICAM-1等的表達(dá)，推測(cè)消痰散結(jié)方可能通過(guò)調(diào)控不同

2、作用的粘附分子的表達(dá)而抗胃癌轉(zhuǎn)移。因此，在與胃癌臨床轉(zhuǎn)移模式相似的動(dòng)物模型上，觀察和比較消痰散結(jié)拆方對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和與之相關(guān)的不同種類(lèi)粘附分子的影響，無(wú)疑使藥物抗轉(zhuǎn)移機(jī)理的研究更加全面并更具有說(shuō)服力。 目的 通過(guò)對(duì)經(jīng)篩選后人胃癌MKN-45裸鼠原位種植瘤模型抑瘤率、肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)、肝臟重量以及轉(zhuǎn)移情況的觀察，評(píng)價(jià)消痰散結(jié)方對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。并運(yùn)用免疫組化和分子生物學(xué)方法探討消痰散結(jié)方對(duì)多種轉(zhuǎn)移相關(guān)的粘附分子E-cad、

3、CD44v6、GMP-140、ICAM-1、VCAM-1等蛋白和mRNA表達(dá)的調(diào)控作用。 方法 1.利用原位移植技術(shù)，將經(jīng)篩選的人胃癌MKN-45瘤株建立在BALB/C裸小鼠腹腔胃壁上，定期觀察裸鼠全身情況和腹部瘤塊生長(zhǎng)體征，待動(dòng)物出現(xiàn)衰竭征象時(shí)處死，解剖觀察瘤塊和主要臟器情況并進(jìn)行病理診斷。 2.BALB/C雄性裸小鼠60只，隨機(jī)分為：空白對(duì)照組、5-Fu組、消痰組、散結(jié)組、消痰散結(jié)組和假手術(shù)組，建立經(jīng)篩選的人

4、胃癌MKN-45裸鼠原位種植模型，手術(shù)三天后給予不同的干預(yù)：分別給予生理鹽水0.2ml灌胃，每日一次；5-Fu稀釋液0.2ml腹腔注射(60mg.kg-1.w-1)，每周1次×3周；消痰方、散結(jié)方、消痰散結(jié)方0.2ml灌胃，每日一次；給藥為期6周。定期觀察裸鼠全身情況和腹部體征。 3.第6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)眼球采血，檢測(cè)血常規(guī)。處死動(dòng)物，收集原位瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率。點(diǎn)數(shù)肝臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)，肝臟稱重。行HE染色，對(duì)腫瘤進(jìn)行病理診斷。

5、 4.取瘤組織和轉(zhuǎn)移臟器行EnVision免疫組化染色，定量分析和比較腫瘤細(xì)胞粘附分子E-cad、CD44v6、GMP-140、ICAM-1、VCAM-1等蛋白的表達(dá)情況。 5.取瘤組織抽提總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA行RT-PCR及SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)，從mRNA水平檢測(cè)和比較E-cad、CD44v6、GMP-140、ICAM-1、VCAM-1等的表達(dá)變化。 結(jié)果 1.成功建立人經(jīng)篩選的

6、胃癌MKN-45裸鼠原位種植模型。造模后第2周起，部分裸鼠可在上腹部觸及較硬腫塊，后腫塊明顯增大，至第8周，動(dòng)物上腹部均可見(jiàn)明顯包塊，透壁可見(jiàn)，質(zhì)地較硬，表面凹凸不平。打開(kāi)腹腔后可見(jiàn)原位種植瘤塊呈灰白色，胃被包繞在瘤塊中。腫瘤轉(zhuǎn)移至肝臟、腸、腹部淋巴結(jié)、肺臟等周?chē)K器。移植瘤原位成瘤率100％，肝臟轉(zhuǎn)移率94.74％。HE染色證實(shí)為低分化腺癌。 2.在不同藥物干預(yù)后第2周，空白對(duì)照組部分裸鼠可在上腹部觸及較硬腫塊，并逐漸增大，至

7、第3周，其余各組也出現(xiàn)相同情況。各組腫瘤體積及抑瘤率結(jié)果如下：5-Fu組、消痰組、散結(jié)組、消痰散結(jié)組的抑瘤率分別為56.52％、46.40％、38.30％、52.49％，化療組、消痰組、消痰散結(jié)組的平均瘤重均顯著小于與空白對(duì)照組平均瘤重(P＜0.05)。消痰散結(jié)與化療組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。點(diǎn)數(shù)不同實(shí)驗(yàn)組肝臟轉(zhuǎn)移灶顯示，5-Fu組、消痰組、散結(jié)組、消痰散結(jié)組與對(duì)照組相比，各組轉(zhuǎn)移灶數(shù)量有不同程度下降，但差異不顯著(P＞0.05

8、)。肝臟稱量后發(fā)現(xiàn)，化療和消痰散結(jié)組平均肝臟重量明顯低于對(duì)照組，(P＜0.05)，與假手術(shù)組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 3.眼球取血測(cè)量白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)和血小板等血液生理指標(biāo)，與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，5-Fu組白細(xì)胞降低差異顯著(P＜0.01)，而其余藥物組與對(duì)照組及假手術(shù)組相比均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。各中藥組的紅細(xì)胞與對(duì)照組相比，均有顯著升高(P＜0.01)，與假手術(shù)組相比，各中藥組均無(wú)顯著差異(P＞0.05)；

9、對(duì)照組和化療組與假手術(shù)組相比，均降低顯著(P＜0.01)，而對(duì)照組與化療組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。散結(jié)組、消痰散結(jié)組的血小板數(shù)與對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)，和假手術(shù)組相比，散結(jié)組和消痰散結(jié)組均無(wú)差異顯著(P＞0.05)。消痰組血小板數(shù)顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)，而與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 4.消痰散結(jié)方對(duì)不同粘附分子蛋白表達(dá)的影響結(jié)果如下: 各處理組在原位瘤和肝臟中偶有E-cad弱陽(yáng)性表達(dá)，

10、在肺中也未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，提示MKN-45細(xì)胞膜上E-cad表達(dá)缺失。比較不同組間CD44v6的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比均顯著降低(P＜0.01)，各藥物組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)意義(P＞0.05)。在肝臟中，消痰組表達(dá)降低有顯著差異(P＜0.05)。在肺中不同的藥物組與對(duì)照組相比表達(dá)差異均不顯著(P＞0.05)。比較不同組間GMP-140的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，消痰組和消痰散結(jié)組均出現(xiàn)表達(dá)的降低(P＜0.01)，消痰組顯著低于5-Fu組；

11、而散結(jié)組表達(dá)差異不顯著(P＞0.05)。在肝臟中消痰組、消痰散結(jié)組表達(dá)下降有顯著差異(P＜0.01)。在肺中不同的藥物組與對(duì)照組相比表達(dá)差異均不顯著(P＞0.05)。比較不同組間ICAM-1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，僅消痰組表達(dá)下降差異顯著(P＜0.05)，其余藥物組間比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。在肝臟中與肺中不同的藥物組與對(duì)照組相比表達(dá)差異均不顯著(P＞0.05)。比較不同組間VCAM-1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，消痰散結(jié)組略高于對(duì)照組，但差異不顯著(P＞0

12、.05)。在肝臟中5-Fu組、散結(jié)組與消痰散結(jié)組出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，但差異并不顯著(P＞0.05)。在肺中不同的藥物組與對(duì)照組相比表達(dá)差異均不顯著(P＞0.05)。 5.消痰散結(jié)方對(duì)不同粘附分子mRNA表達(dá)的影響結(jié)果如下：RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳比較灰度值顯示，在E-cad的表達(dá)中，各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。在CD44v6的表達(dá)中，與對(duì)照組相比，各組顯著下調(diào)表達(dá)(P＜0.01)。在GMP-140的表達(dá)中，與對(duì)照組相比消痰組、消

13、痰散結(jié)組表達(dá)下降差異顯著(P＜0.01)。在ICAM-1的表達(dá)中，與對(duì)照組相比各組表達(dá)均未見(jiàn)顯著差異(P＞0.05)。在VCAM-1的表達(dá)中，與對(duì)照組相比消痰散結(jié)出現(xiàn)顯著上調(diào)(P＜0.01)，其余各組表達(dá)均未見(jiàn)顯著差異(P＞0.05)。 6.采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)不同粘附分子的表達(dá)情況可見(jiàn)：在E-cad中，各組間表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。在CD44v6中，對(duì)照組相比，消痰組、散結(jié)組、消痰散結(jié)組表達(dá)降低差異顯著(P＜0.

14、01)。在GMP-140中，與對(duì)照組相比，消痰組和消痰散結(jié)組表達(dá)降低差異顯著(P＜0.01)。在ICAM-1的表達(dá)中，各組均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。在VCAM-1的表達(dá)中，與對(duì)照組相比，散結(jié)組與消痰散結(jié)組均出現(xiàn)顯著上調(diào)(P＜0.01)。 結(jié)論 1.利用篩選后的人胃腺癌MKN-45瘤株建立起來(lái)的裸鼠原位移植模型，具有與臨床胃癌相似的表現(xiàn)，具有肝臟轉(zhuǎn)移的靶向特點(diǎn)。 2.消痰散結(jié)方對(duì)人胃癌裸鼠原位移植瘤的增長(zhǎng)具有明