家蠶近交系遺傳檢測(cè)及其方法的研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，用作實(shí)驗(yàn)遺傳動(dòng)物的歷史已達(dá)百年。其遺傳背景清楚，各種突變性狀豐富，而且具有體型小、繁殖周期短、繁殖系數(shù)高、易飼養(yǎng)等特點(diǎn)，具備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳特性。采用高度近交的動(dòng)物可減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量和實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和可重復(fù)性。近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的顯著特點(diǎn)是其基因純合性及遺傳穩(wěn)定性，但在培育、保種及繁殖生產(chǎn)過程中，存在著發(fā)生遺傳變異或遺傳污染的可能，所以需要對(duì)近交系進(jìn)行嚴(yán)格、定時(shí)的遺傳

2、檢測(cè)。對(duì)于家蠶，以培育理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為目的的高度近交系研究，目前還處于起步階段，因此近交系的遺傳檢測(cè)也是近交系培育工作的需要。有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了利用皮膚移植法、免疫標(biāo)記基因檢測(cè)法和生化基因標(biāo)記檢測(cè)法等進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。近年來分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，可以直接檢驗(yàn)動(dòng)物基因組核酸的改變，為家蠶近交系的遺傳檢測(cè)提供了直接、客觀的途徑。 本研究利用RAPD引物或SSR引物對(duì)家蠶全同胞交配近交系BmIS-C108和BmIS-Dazao

3、，以及28個(gè)同源導(dǎo)入近交系進(jìn)行了遺傳純度的檢測(cè)，期望能探索并初步建立家蠶近交系遺傳純度檢測(cè)的技術(shù)體系，為家蠶實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化、模式生物化等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下： 1、家蠶近交系BmIS-C108的RAPD檢測(cè) 以培育系的親本19-100為對(duì)照品系，利用28條隨機(jī)引物，采用RAPD-PCR技術(shù)對(duì)家蠶20代全同胞交配近交系IS-C108的3個(gè)蛾區(qū)：IS-C10820-1、IS-C10820-2、IS-C10820-3，各

4、30個(gè)個(gè)體進(jìn)行了遺傳純度檢測(cè)。28條引物在IS-C108的3個(gè)蛾區(qū)中分別擴(kuò)增出183條、182條、182條帶，其中多態(tài)性條帶分別為7條、5條、5條，多態(tài)性帶頻率分別為3.825％、2.747％、2.747％，平均為3.106％；在親本19.100中擴(kuò)增出189條帶，多態(tài)性條帶為17條，多態(tài)性帶頻率為8.995％。在品系間，IS.C108蛾區(qū)間的多態(tài)性頻率僅為6.486％，比親本19-100多態(tài)性帶頻率(8.995％)小，IS-C108與

5、19-100的多態(tài)性頻率為22.751％。IS-C10820-1、IS-C10820-2、IS-C10820-3這3個(gè)群體的遺傳純度分別為0.9976、0.9982、0.9982，平均為0.9980，親本19-100蛾區(qū)內(nèi)的遺傳純度為0.8994。 2、家蠶近交系BmlS-C108的SSR檢測(cè) 對(duì)上述實(shí)驗(yàn)材料采用SSR-PCR技術(shù)進(jìn)行遺傳檢測(cè)，所使用的28對(duì)SSR引物分別屬于家蠶SSR標(biāo)記連鎖圖的28個(gè)連鎖群。28對(duì)引物

6、在IS-C108的3個(gè)蛾區(qū)中均擴(kuò)出61條帶，其中多態(tài)性條帶均為1條，多態(tài)性帶頻率也均為1.639％：在親本19-100中擴(kuò)增出73條帶，其中多態(tài)性條帶為5條，多態(tài)性帶頻率為6.849％。在品系間，IS-C108蛾區(qū)間的多態(tài)性頻率僅為3.279％，IS-C108與19-100的多態(tài)性頻率為20.548％。家蠶近交系IS-C108的3個(gè)蛾區(qū)的平均等位基因數(shù)、平均觀測(cè)雜合度、平均期望雜合度和Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)都分別為2.

7、179、0.016、0.016、0，親本19-100相對(duì)應(yīng)的值為：2.964、0.068、0.046、0.478。C108近交系的3個(gè)蛾區(qū)的Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)(D)都為0，結(jié)果表明該近交系的基因型的分布處于平衡狀態(tài)，而19-100的相應(yīng)數(shù)值為0.478，表明品系19.100的雜合子過剩。IS-C10820-1、IS-C10820-2、IS-C10820-3這3個(gè)群體的遺傳純度的分別為0.9984、0.99989、0

8、.9984，平均為0.9986，親本19.100蛾區(qū)內(nèi)的遺傳純度為0.9185。 3、家蠶近交系BmlS-Dazao的SSR檢測(cè) 以培育系的親本19-200為對(duì)照品系，利用20對(duì)SSR引物，采用SSR-PCR技術(shù)對(duì)家蠶20代全同胞交配近交系IS-Dazao的3個(gè)蛾區(qū)：Is-Daza020-1、IS-Daza020-2、IS-DaTa020-3，各30個(gè)個(gè)體進(jìn)行了遺傳純度檢測(cè)。20對(duì)引物在IS-Dazao的3個(gè)蛾區(qū)中均擴(kuò)增

9、出51條帶，其中多態(tài)性條帶均為1條，多態(tài)性頻率也均為1.961％：在親本19-200中擴(kuò)增出52條帶，多態(tài)性條帶為2條，多態(tài)性帶頻率為3.846％。在品系間，IS-Dazao 3個(gè)蛾區(qū)個(gè)體間的多態(tài)性頻率為3.846％，與親本19-200多態(tài)性帶頻率(3.846％)相當(dāng)。IS-Dazao 3個(gè)蛾區(qū)的平均等位基因數(shù)、平均觀測(cè)雜合度、平均期望雜合度、Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)均分別為2.550、0.020、0.020、0；遺傳純

10、度分別為：0.9993、0.9987、0.9993，平均為0.9991；親本19-200系統(tǒng)的平均等位基因數(shù)、平均觀測(cè)雜合度、平均期望雜合度均、Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)、遺傳純度分別為2.600、0.038、0.038、O、0.9980。結(jié)果表明IS-Dazao和培育系的親本19-200的基因型分布處于平衡狀態(tài)，IS-Dazao的遺傳純度較高，平均為99.91％。 4、家蠶同源導(dǎo)入近交系的SSR檢測(cè) 采用

11、SSR-PCR技術(shù)對(duì)家蠶28個(gè)同源導(dǎo)入近交系進(jìn)行了遺傳檢測(cè)，所使用的28對(duì)SSR引物分別屬于家蠶SSR標(biāo)記連鎖圖的28個(gè)連鎖群。得到28個(gè)同源導(dǎo)入近交系的遺傳相似系數(shù)均為100％。結(jié)果表明，經(jīng)20代以上的回交，除目的基因外，均為輪回親本的遺傳組成。對(duì)其中的大造K進(jìn)行了個(gè)體DNA的基因型分析，檢測(cè)群體遺傳純度，實(shí)驗(yàn)值為100％，說明同源導(dǎo)入近交系的遺傳純度很高。 5、兩種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)同一近交系進(jìn)行遺傳檢測(cè)的比較 本研究同

12、時(shí)采用RAPD、SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)家蠶20代全同胞近交系IS-C108進(jìn)行了遺傳純度檢測(cè)，結(jié)果如上述1、2.(1)多態(tài)水平的比較：采用RAPD分子標(biāo)記擴(kuò)增出的條帶數(shù)和多態(tài)性帶頻率在蛾區(qū)內(nèi)和品系間都較SSR分子標(biāo)記高。(2)遺傳純度的比較：采用RAPD分子標(biāo)記得到IS-C108遺傳純度的平均值為0.9980，SSR分子標(biāo)記得到IS-C108遺傳純度的平均值為0.9986，僅相差0.0006。兩種方法檢測(cè)結(jié)果均揭示近交系IS-C108的遺

13、傳純度達(dá)到了預(yù)期的人于0.99以上的標(biāo)準(zhǔn)，這與IS-C108經(jīng)過20代全同胞交配的理論預(yù)測(cè)是一致的，說明這兩種分子標(biāo)記技術(shù)都適合于家蠶近交系的遺傳檢測(cè)。比較之下，一條隨機(jī)引物可以檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)，因此同樣的實(shí)驗(yàn)規(guī)模，所檢測(cè)到的位點(diǎn)覆蓋基因組的范圍更大，而且RAPD經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)進(jìn)程更加迅速，是一種經(jīng)濟(jì)快速的檢測(cè)方法：一對(duì)SSR引物一般檢測(cè)的是單位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性比RAPD好，實(shí)驗(yàn)流程與RAPD相似，操作也簡(jiǎn)單，因此是一種較理想的檢