硫糖鋁在體內(nèi)外對VacA-IgY保護(hù)作用的探討.pdf

1、目的:用pQE30-vacA-DH5α工程菌大量表達(dá)幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）細(xì)胞空泡毒素（vacuolating cytotoxin A，VacA）的毒性片斷，以此重組蛋白為抗原，制備高效價(jià)的抗H.pylori重組VacA的雞蛋黃抗體（immunoglobulinyolk，IgY），即VacA-IgY，為研制H.pylori治療性抗體制劑奠定基礎(chǔ)。 方法: 1、通過大量培養(yǎng)并

2、誘導(dǎo)重組菌pQE30-vacA-DH5α，獲得重組蛋白VacA；SDS-PAGE分析其表達(dá)形式；經(jīng)Nj2+-NTA樹脂純化后，Bradford法測定蛋白濃度；Western blot法鑒定抗原性；以重組VacA蛋白免疫兔，ELISA法測定多克隆抗血清效價(jià)以鑒定重組蛋白免疫原性。 2、用純化的重組蛋白免疫依莎產(chǎn)蛋母雞，制備VacA-IgY，建立檢測VacA-IgY的ELISA法，測定其效價(jià)；將高效價(jià)的IgY混合，飽和硫酸銨法純化后

3、，SDS-PAGE測定純度，Bradford法測定蛋白含量，ELISA法測定效價(jià)。 結(jié)果: 1.SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白相對分子量為27000，主要以包涵體形式表達(dá)；經(jīng)Nj2+-NTA柱純化后，純度達(dá)90％以上，Bradford法測得蛋白含量為0.376mg/ml；經(jīng)鑒定，重組蛋白具有較好的抗原性和免疫原性。 2.獲得的VacA-IgY經(jīng)濃縮純化后，效價(jià)為1：2560，純度為72.0％，蛋白濃度為6.36

4、mg/ml。 結(jié)論:成功地獲得了較高濃度和純度的重組蛋白VacA，并制備了較高濃度和效價(jià)的特異性VacA-IgY。 目的:觀察硫糖鋁對抗幽門螺桿菌重組細(xì)胞空泡毒素抗原（VacA）蛋黃抗體（IgY）的保護(hù)作用，為制備能耐受胃酸和蛋白酶的IgY制劑奠定基礎(chǔ)。 方法:在不同pH值的VacA-IgY液中加入不同濃度的硫糖鋁和不同濃度的胃蛋白酶，ELISA法檢測硫酸鋁對酸破壞和胃蛋白酶裂解的保護(hù)作用；將含不同濃度硫糖鋁的V

5、acA-IgY反復(fù)凍融7次，將含30％硫糖鋁的IgY室溫放置1d～4w，ELISA法測定各實(shí)驗(yàn)組VacA-IgY的相對抗體活性（Ar/Ac）。 結(jié)果:在pH1.5、2.0、3.0的條件下，含30％-60％硫糖鋁的VacA-IgY抗體活性高于不加硫糖鋁的VacA-IgY；在pH1.5條件下，60％硫糖鋁可使IgY抗體活性保持68.7％；在pH2.0和3.0條件下，50％、40％的硫糖鋁可完全保持IgY抗體活性。在pH值為1.5～3

6、.0，正常胃蛋白酶濃度（0.02mg/ml）下，30％以上硫糖鋁均可有效保護(hù)IgY的活性，增強(qiáng)其抗凍融的能力，室溫放置1個(gè)月后，仍保持80％以上的抗體活性。 結(jié)論:30％以上的硫糖鋁可增強(qiáng)VacA-IgY對低pH和胃蛋白酶的耐受能力，增強(qiáng)其抗凍融能力，是較理想的IgY保護(hù)劑。 目的:觀察在體內(nèi)VacA-IgY抗H.pylori感染中，硫糖鋁對IgY的保護(hù)作用，為制備能耐受胃內(nèi)生態(tài)環(huán)境的IgY制劑奠定基礎(chǔ)。 方法:

7、以灌胃法建立H.pylori國際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637感染BALB/c小鼠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，以H.pylori western blot試劑盒檢測血清中抗H.pylori特異性IgG抗體；將血清抗體呈陽性小鼠分為用高中低劑量的VacA-IgY治療組和硫糖鋁-VacA-IgY治療組，單純硫糖鋁治療組及感染對照組，治療后參照新悉尼系統(tǒng)直觀模擬等級(jí)圖對各組小鼠胃部H.pylori定植及慢性炎癥情況進(jìn)行評分，SPSS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

8、 結(jié)果:各治療組均未能減輕小鼠感染模型中H.pylori的定植密度。高劑量VacA-IgY，高中低劑量硫糖鋁-VacA-IgY治療組可減輕感染小鼠胃黏膜嗜中性粒細(xì)胞和慢性炎癥細(xì)胞浸潤。高劑量（4mg天，共7天）VacA-IgY和高（4mg/天，共7天）、中（2mg/天，共7天）、低劑量（0.5mg/天，共7天）硫糖鋁-VacA-IgY均能對H.pyolori引起的胃黏膜慢性炎癥起到治療作用。 結(jié)論: BALB/c小鼠感染模