BafilomycinA1對鈷納米顆粒所致體內(nèi)外不良生物學效應保護作用的實驗研究.pdf

1、第一部分Bafilomycin A1抑制鈷納米顆粒誘導的小鼠巨噬細胞細胞毒性和促炎細胞因子的釋放的實驗研究
　　目的：研究Bafilomycin A1對鈷納米顆粒（CoNPs）誘導的小鼠巨噬細胞細胞毒性和炎癥反應的保護作用。
　　方法：
　?。?）采用不同濃度的CoNPs、Co2+和Bafilomycin A1對RAW264.7細胞進行甲基噻唑基四唑（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法

2、檢測細胞生存率；
　?。?）通過對照組、CoNPs組、低劑量藥物組、高劑量藥物組四組 MTT分析方法檢測細胞生存率比較，評估Bafilomycin A1對CoNPs細胞毒性的抑制作用；
　?。?）采用 DAPI對RAW264.7細胞核進行染色，熒光顯微鏡觀察細胞數(shù)量的變化；
　?。?）掃描電鏡觀察各組RAW264.7細胞超微形態(tài)學的變化；（5）采用ELISA法檢測前炎癥因子TNF-α、IL-1β、 IL-6的表達情況。

3、
　　結果：
　　（1） CoNPs及 Co2+對RAW264.7細胞的細胞毒性效應呈現(xiàn)時間、濃度依賴性；Bafilomycin A1（8nM，16nM）對RAW264.7細胞沒有細胞毒性；CoNPs和Co2+細胞毒性的起效濃度分別約為50、400μM；
　?。?）隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高 RAW264.7細胞的細胞毒性逐漸減弱（P<0.05）；
　?。?）熒光顯微鏡觀察隨著Bafilomy

4、cin A1作用濃度的增高RAW264.7細胞數(shù)量逐漸增加；
　?。?）掃描電鏡觀察顯示CoNPs組的RAW264.7細胞偽足基本消失，且細胞明顯縮??；隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高RAW264.7細胞的偽足逐漸增多，且細胞鋪展面積逐漸與對照組接近；
　?。?）隨著 Bafilomycin A1作用濃度的增高炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達逐漸減弱（P<0.05）。
　　結論：CoNPs對R

5、AW264.7細胞的細胞毒性效應強于 Co2+；Bafilomycin A1（8nM，16nM）沒有細胞毒性。Bafilomycin A1對CoNPs所致RAW264.7細胞的細胞毒性和炎癥反應具有保護作用。
　　第二部分Bafilomycin A1抑制鈷納米顆粒誘導的小鼠巨噬細胞向破骨細胞分化的實驗研究
　　目的：研究探索Bafilomycin A1對CoNPs誘導的RAW264.7細胞分化的影響。
　　方法：

6、>　?。?） RAW264.7細胞培養(yǎng)第5d，通過倒置相差顯微鏡觀察活體破骨細胞形態(tài)改變、TRAP染色、TRAP染色陽性細胞計數(shù)，從細胞形態(tài)學上來評估Bafilomycin A1抑制CoNPs誘導巨噬細胞向破骨細胞分化的作用；
　?。?）培養(yǎng)第6d通過 Real-time PCR檢測破骨細胞基因表達從基因水平來評估Bafilomycin A1抑制CoNPs誘導巨噬細胞向破骨細胞分化的作用。
　　結果：
　　（1）培養(yǎng)第

7、5d，通過倒置相差顯微鏡觀察，CoNPs組不規(guī)則細胞數(shù)量增加，體積增大，多核細胞亦增多，其內(nèi)的細胞核也增多。隨著 Bafilomycin A1作用濃度的增加，多核細胞數(shù)目逐漸減少，多核細胞體積逐漸變?。煌ㄟ^TRAP染色，CoNPs組有大量TRAP染色陽性的破骨細胞形成，隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加，TRAP染色陽性的破骨細胞數(shù)目逐漸減少（p<0.05）。
　?。?）培養(yǎng)第6dReal-time PCR檢測破骨細胞

8、基因TRAP、RANK及Cath-K的表達，所得結果規(guī)律性與活體破骨細胞形態(tài)改變、TRAP染色結果一致。
　　結論：小鼠RAW264.7細胞能夠被RANKL誘導生成破骨細胞，CoNPs能夠加速誘導巨噬細胞向破骨細胞分化，Bafilomycin A1能夠抑制CoNPs誘導巨噬細胞向破骨細胞分化的進程，呈劑量依賴性。
　　第三部分Bafilomycin A1對鈷納米顆粒誘導的小鼠巨噬細胞不良生物學效應保護作用的機制研究
　

9、　目的：研究 pH值對CoNPs溶解的影響，通過H+-ATPase抑制劑Bafilomycin A1抑制RAW264.7對細胞內(nèi)的CoNPs溶解的影響、TEM超微結構改變及氧化應激水平的影響，初步探討B(tài)afilomycin A1對CoNPs所致體內(nèi)外不良生物學效應保護作用的機制。
　　方法：
　?。?）通過ICP-MS測量 CoNPs在不同 pH值培養(yǎng)基中釋放 Co2+的水平；
　?。?）各實驗組細胞通過 ICP-MS

10、測量及 EDX能譜測試，評估Bafilomycin A1抑制細胞內(nèi)CoNPs溶解作用；
　?。?）利用TEM觀察各組RAW264.7細胞超微結構的改變；
　　（4）收集各組RAW264.7細胞抽提液，通過GSH/GSSG、SOD、CAT、GPx水平檢測，評估 Bafilomycin A1抑制細胞內(nèi)氧化應激的作用。
　　結果：
　?。?）培養(yǎng)基中離子釋放呈現(xiàn)時間、pH值依賴關系，各時間點釋放的濃度均小于 Co2+細

11、胞毒性起效濃度；
　?。?）細胞內(nèi) CoNPs離子釋放呈現(xiàn)時間依賴關系，隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加，細胞內(nèi)CoNPs離子釋放逐漸減少（P<0.05）；
　　（3）CoNPs組RAW264.7細胞內(nèi)溶酶體和濾泡的數(shù)目急劇增多，CoNPs被溶酶體吞噬，伴有細胞器消失；隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高，RAW264.7細胞內(nèi)溶酶體和濾泡的數(shù)目逐漸減少，同時消失的細胞器再次出現(xiàn)；
　?。?）C

12、oNPs組 GSH、SOD、GPx、CAT水平明顯降低，隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高，GSH、SOD、GPx、CAT水平相應升高。
　　結論： CoNPs的溶解度在細胞外環(huán)境中很低，在細胞內(nèi)低 pH值環(huán)境的溶酶體中更容易溶解釋放大量鈷離子，從而破壞細胞抗氧化防御機制，引起氧化應激損傷，是CoNPs引起細胞毒性反應、炎癥反應及誘導破骨細胞分化等一系列不良生物學反應的根本原因。
　　第四部分Bafilomyci

13、n A1抑制鈷納米顆粒誘導的小鼠顱骨周圍急性炎癥反應和骨溶解作用的實驗研究
　　目的：研究Bafilomycin A1對CoNPs誘導的小鼠顱骨周圍急性炎癥反應和骨溶解作用的影響。
　　方法：
　?。?）建立小鼠顱骨周圍急性炎癥反應和骨吸收注射模型，各組顱骨周圍軟組織病理學切片染色觀察及炎癥細胞計數(shù)分析；
　　（2）各組顱骨病理學切片染色觀察及骨組織計量學數(shù)據(jù)測量；
　?。?）各組 Micro-CT分析；（

14、4）各組顱骨周圍軟組織促炎細胞因子的測量。
　　結果：
　　（1）顱骨周圍軟組織病理學切片染色觀察及炎癥細胞計數(shù)分析結果提示CoNPs組細胞浸潤最密集，滿視野均是核染成深藍色巨噬細胞或淋巴細胞，隨著 Bafilomycin A1作用濃度的增加，炎性細胞浸潤數(shù)目逐漸減少（p<0.05）。
　　(2)顱骨病理學切片染色觀察及骨組織計量學數(shù)據(jù)測量結果提示CoNPs組的樣本可見顱骨骨吸收明顯，伴炎性細胞浸潤。隨著 Bafilo

15、mycin A1作用濃度的增加，骨吸收破壞范圍減小，溶解面積減小，炎性細胞浸潤數(shù)目逐漸減少。
　　(3)Micro-CT分析結果提示CoNPs組骨吸收明顯、隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加，骨吸收破壞范圍減小。隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加BMD和BMC顯著升高(P<0.05)。
　?。?）顱骨周圍軟組織促炎細胞因子表達結果提示 CoNPs組軟組織內(nèi) TNF-α、IL-1β及 IL-6蛋白表達量