轉(zhuǎn)錄因子KLF9對(duì)人肝癌細(xì)胞的體內(nèi)外生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:Krüppel-like因子(KLFs)是一組與真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)的鋅指蛋白。KLFs有17個(gè)家族成員，其羧基末端高度保守，含有3個(gè)串聯(lián)的Cys2/His2鋅指狀結(jié)構(gòu)，用于結(jié)合DNA;其氨基末端在不同的家族成員間存在較大差異，主要是通過結(jié)合輔助因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。KLFs不同成員表達(dá)具組織分布特異性和分化、發(fā)育上的階段性;KLFs調(diào)控多種富含GC或CACCC啟動(dòng)子的基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡的生理過程，與

2、心血管疾病、代謝異常疾病、腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。KLF9是KLFⅢ類亞家族成員，最初被命名為基本轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合蛋白1(BTEB1)，在不同細(xì)胞內(nèi)對(duì)靶基因發(fā)揮抑制或激活等不同功能。已有報(bào)道表明，KLF9在腸癌中低表達(dá);在雌激素受體陰性的子宮內(nèi)膜癌中低表達(dá)、而在雌激素受體陽性的子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)。另外，KLF9可通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的干性特征而被認(rèn)為是該腫瘤的一個(gè)抑癌基因。但是，KLF9與肝癌的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究旨在探

3、討KLF9在人肝癌組織中表達(dá)情況及其對(duì)人肝癌細(xì)胞生長的體內(nèi)、外生物學(xué)效應(yīng)和相關(guān)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:利用Real-time RT-PCR分析了15對(duì)肝癌和癌旁及不同肝癌細(xì)胞系中KLFⅢ家族成員KLF9，KLF10，KLF11，KLF13的表達(dá)情況;分析了肝癌細(xì)胞系SK-Hep1經(jīng)化療藥物阿霉素處理后KLFⅢ家族成員的表達(dá)情況。利用誘導(dǎo)表達(dá)(TET-ON)慢病毒系統(tǒng)將KLF9、KLF9的SIN3A作用功能域缺失突變體(KLF9ΔSI

4、D)和鋅指功能域缺失突變體(KLF9ΔZNF)表達(dá)單元轉(zhuǎn)入人肝腫瘤細(xì)胞SK-Hep1和HepG2中，建立穩(wěn)定細(xì)胞系;通過MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期測定，來驗(yàn)證KLF9及其缺失突變體對(duì)細(xì)胞生長和增殖的能力;通過流式細(xì)胞儀檢測Annexin-Ⅴ-APC/7-AAD陽性細(xì)胞比例;利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測KLF9和p53相互作用;通過細(xì)胞熒光染色檢測KLF9和p53在細(xì)胞內(nèi)的定位及表達(dá);通過RNA干擾下調(diào)SK-Hep1-Tet-on-KLF9

5、細(xì)胞中的p53表達(dá)，并觀察下調(diào)p53功能對(duì)KLF9誘導(dǎo)凋亡的影響。進(jìn)一步通過裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證KLF9的生物學(xué)效應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果: KLF9在多數(shù)肝癌標(biāo)本中的表達(dá)低于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織，其在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯低于正常肝細(xì)胞的表達(dá)。比較阿霉素處理和未處理的SK-Hep1細(xì)胞的RNA Microarray結(jié)果，KLF家族中KLF9表達(dá)上調(diào)最為明顯。在人肝癌細(xì)胞SK-Hep1和HepG2中過表達(dá)KLF9后，可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。MTT

6、、克隆形成和細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，KLF9過表達(dá)后細(xì)胞生長明顯受到抑制，細(xì)胞周期S期細(xì)胞明顯減少，阻滯于G2期。凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組相比，隨KLF9表達(dá)時(shí)間增多而增高。在蛋白水平檢測中發(fā)現(xiàn)，KLF9導(dǎo)致p53蛋白的水平增高;在加入蛋白合成抑制劑CHX條件下，KLF9能提高p53的穩(wěn)定性;另外，p53的下游基因puma，noxa和p21也可被KLF9誘導(dǎo)升高。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中KLF9和p53能夠相互結(jié)合;通過細(xì)胞熒光

7、染色發(fā)現(xiàn)兩者可以在核內(nèi)共定位。當(dāng)干擾下調(diào)p53的功能，能夠削弱KLF9誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的能力。在體外，KLF9兩個(gè)缺失突變體具有不同的功能效應(yīng);與野生型KLF9相比，KLF9ΔSID突變體仍然可以誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，并可活化p53及其下游靶基因表達(dá)，而KLF9ΔZNF突變體則無此效應(yīng)。小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)照組給予正常水或DOX組都可以在體外成瘤，且成瘤的大小無明顯差異;而KLF9誘導(dǎo)表達(dá)可以顯著抑制SK-Hep1細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力;對(duì)已長

8、出的腫瘤的小鼠，DOX飲用水誘導(dǎo)表達(dá)KLF9，也可致腫瘤生長抑制或消失。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1）KLF9在大多數(shù)肝癌組織中的表達(dá)低于相應(yīng)癌旁組織;2）KLF9過表達(dá)后可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡;3）KLF9可以促進(jìn)p53蛋白水平表達(dá)，并增加p53蛋白的穩(wěn)定性;4）干擾抑制p53功能，可削弱KLF9誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力;5）在體外，KLF9誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡依賴于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域;6）KLF9可以抑制腫瘤細(xì)胞體內(nèi)成瘤和已生成腫瘤的生長;在肝