小麥無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因體系建立和HMW--GS基因的轉(zhuǎn)化_314.pdf

1、高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)是小麥籽粒貯藏蛋白的重要成分，影響著面團(tuán)彈性和加工品質(zhì)。AS208為輪選987組織培養(yǎng)后代中鑒定出的無(wú)性系變異體，該材料缺失了1Bx20和1By20亞基，雖與對(duì)照輪選987相比其面包品質(zhì)明顯變差，但在鑒定其他HMW-GS功能和培育優(yōu)質(zhì)弱筋小麥等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。本研究擬在建立AS208、濟(jì)麥22和矮抗58等中國(guó)商業(yè)化推廣小麥品種（系）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系及無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株獲得體系的基礎(chǔ)上，將相關(guān)HMW

2、-GS基因轉(zhuǎn)入AS208等小麥材料中。主要研究結(jié)果如下:
　　1、以科農(nóng)199、新春9號(hào)、CB037、Fielder和AS208等小麥品種（系）幼胚為材料進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，建立了這些小麥品種（系）幼胚為外植體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系，并成功轉(zhuǎn)化了大面積推廣品種科農(nóng)199、師欒02-1、石4185、川麥42和冀麥5265，轉(zhuǎn)化效率分別達(dá)到22.7％、9.9％、8.0％、8.3％和14.7％。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行試紙條檢測(cè)，陽(yáng)性植株率達(dá)到90％

3、以上。
　　2、通過(guò)培養(yǎng)基改良和愈傷組織生理狀態(tài)調(diào)整，建立了小麥成熟胚高效再生體系，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化Verry、 CB037成熟胚成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率分別為0.23％和0.61％。
　　3、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將攜帶GUS和bar基因的雙T-DNA載體成功轉(zhuǎn)入了科農(nóng)199、新春9號(hào)、CB037和Fielder等小麥品種（系），對(duì)轉(zhuǎn)基因植株T0代進(jìn)行組織化學(xué)染色、試紙條、PCR和Southern blot檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)

4、基因和標(biāo)記基因共轉(zhuǎn)化效率為49.0％左右。對(duì)T1代植株中的GUS和bar基因進(jìn)行組織化學(xué)染色、試紙條、PCR和Southern blot檢測(cè)，獲得了只含有GUS基因而不含有bar基因的轉(zhuǎn)基因植株;通過(guò)統(tǒng)計(jì)T1代中不同基因組合的頻率，發(fā)現(xiàn)無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株頻率為14.5％。結(jié)合Southern blot檢測(cè)結(jié)果，認(rèn)為載體上2段T-DNA區(qū)的長(zhǎng)度和比例影響了2個(gè)基因在小麥基因組上整合的拷貝數(shù)和表達(dá)水平，進(jìn)而影響了目標(biāo)基因和標(biāo)記基因的分離。

5、
　　4、通過(guò)對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行試紙條和PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)bar基因在T1代中普遍存在沉默現(xiàn)象，沉默率達(dá)33.5％;而T1代中對(duì)GUS基因進(jìn)行的PCR檢測(cè)與組織化學(xué)染色結(jié)果一致，證明T1代中GUS基因沒有發(fā)生沉默。通過(guò)重亞硫酸鹽對(duì)bar基因測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)bar基因沉默由35S啟動(dòng)區(qū)一些位點(diǎn)的甲基化引起。
　　5、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將攜帶1By8、1Bx20、1By20和1Sx2.3等HMW-GS基因的雙T-DNA植物表達(dá)

6、載體轉(zhuǎn)入了AS208中，利用試紙條共檢測(cè)出69株轉(zhuǎn)基因植株，其中，轉(zhuǎn)1By8植株20株，轉(zhuǎn)1Bx20植株20株，轉(zhuǎn)1By20植株19株，轉(zhuǎn)1Sx2.3植株10株。同時(shí)，對(duì)獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株中的Glu-1B基因進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有1By8基因植株4株，含有1Bx20基因植株8株，含有1By20基因植株5株，含有1Sx2.3基因植株4株。進(jìn)一步對(duì)從陽(yáng)性植株籽粒中提取的HMW-GS進(jìn)行SDS-PAGE分離鑒定，發(fā)現(xiàn)除1Sx2.3亞基在