水稻種胚特異基因OsESG1的生物學功能分析.pdf

1、類受體蛋白激酶（receptor-like kinase，RLKs）是植物蛋白激酶的一個家族，它作為信號分子的受體，能夠通過胞外受體結構域感受外界刺激，并通過胞內激酶域進行磷酸化或去磷酸化，對下游靶基因的轉錄以及表達進行調控，從而參與胞內信號轉導，在植物生長發(fā)育及環(huán)境應答過程中發(fā)揮作用。類受體蛋白激酶根據胞外結構的不同可以分為四類，其中具有S結構域(S-domain)的類受體蛋白激酶（S-RLKs）是比較重要的一類，目前，部分S-RLK

2、s已被克隆，證明其在植物發(fā)育及自交不親和等方面發(fā)揮作用，但該類蛋白激酶參與脅迫響應的報道較少。
　　實驗室前期在水稻中克隆了一個種胚特異基因，命名為OsESG1（HE584611），該基因編碼一個S-RLKs。結合基因工程技術，通過構建反義OsESG1表達載體，結合農桿菌介導的遺傳轉化，獲得了該基因的反義轉基因水稻，命名為AOsESG1（簡寫為AS）。
　　本研究中，主要通過將OsESG1進行原核蛋白表達，并對基因表達特異性

3、進行分析，結合OsESG1在不同處理條件下的表達模式，進一步對轉基因水稻AS的表型及其在鹽、干旱等條件下的生物學功能進行研究，結合對轉基因水稻中差異表達基因的篩選，力圖全面闡明OsESG1基因功能，并為構建基因調控網絡提供線索及證據，相關研究結果如下：
　　1、OsESG1的原核表達：構建OsESG1的原核表達載體OsESG1-pET-28a(+)，轉入大腸桿菌BL21中進行誘導表達，得到約80 kDa的蛋白質條帶。蛋白的表達量隨

4、著誘導時間延長而增加，在誘導7h后達到最高表達量，之后隨誘導時間的延長，蛋白表達量基本不變，維持在一定的水平。不同濃度的IPTG對蛋白表達的誘導能力有所不同：低濃度的IPTG幾乎不能誘導蛋白的表達，隨IPTG濃度升高，蛋白誘導表達量也逐漸升高，在IPTG濃度升高至1 mmol后，其對蛋白的誘導能力穩(wěn)定在一定水平，不再升高。
　　2、OsESG1的表達模式分析：利用半定量RT-PCR的方法對OsESG1的表達模式進行分析，結果顯示：

5、OsESG1在水稻種胚中表達量較高，在其他器官中有少量表達；經ABA、Me-JA、GA3處理后，OsESG1在水稻葉片被誘導表達，IAA對OsESG1在水稻根中的表達具有一定的抑制作用。高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫能夠誘導OsESG1在水稻根中的表達，其中干旱對基因的誘導作用較明顯。
　　3、OsESG1的生物學功能研究：以轉基因水稻 AS為材料，對OsESG1的生物學功能進行分析。對轉基因水稻的表型分析顯示：轉基因水稻的不定根數

6、目減少，初生根長度也受到一定程度的抑制，顯示OsESG1在調控水稻根系發(fā)育過程中具有一定的作用。通過對在干旱處理下轉基因水稻相關生理指標的測定顯示：干旱條件下轉基因水稻失水較快、MDA大量積累、膜損傷程度高于對照。轉基因水稻的抗旱能力低于野生型，顯示OsESG1表達量的降低對水稻抗旱能力有一定影響，OsESG1可能在水稻的抗旱過程中發(fā)揮作用。轉基因水稻在黑暗條件下葉片衰老程度高于對照，暗示OsESG1可能參與水稻的衰老進程。
　　

7、4、高通量表達譜的測定：利用RNA-Seq技術篩選并分析轉基因水稻的差異表達基因（Different expression genes，DEGs），結果顯示，相對于對照材料，轉基因水稻內1072個基因表達上調，740個基因表達下調。DEGs表達的蛋白質主要分布于細胞質，其功能集中在陽離子結合過程。對其中部分基因的表達模式進行 qRT-PCR驗證，結果證實參考基因的表達模式與表達譜結果測定相符合，結果可信。結合基因的功能分類，進一步分析差

8、異表達基因。其中生長素相關基因如2個Aux/IAA家族基因表達上調，7個SAURs家族基因表達下調，從而顯示OsESG1基因表達變化導致IAA參與調控的相關功能受到一定程度的影響，進一步影響根部的發(fā)育及表型，與轉基因水稻根系發(fā)育變化的表型一致；部分其它激素相關的基因表達也發(fā)生了不同程度的變化，其中細胞分裂素合成關鍵酶—異戊烯基轉移酶基因家族的7個基因表達下調，細胞分裂素脫氫酶基因家族的2個基因表達上調，相關基因的表達變化會導致細胞分裂素

9、合成抑制，顯示OsESG1基因表達的變化導致細胞分裂素的水平降低，這與轉基因水稻暗誘導的葉片衰老程度加劇表型一致；同時，其他參與代謝調控及脅迫響應等過程的部分基因的表達也發(fā)生改變，其中過氧化物酶基因家族的12個基因表達下調，導致轉基因水稻抗氧化能力降低，部分轉錄因子的表達也發(fā)生變化，其中5個WRKY轉錄因子基因表達明顯下調，對轉基因水稻的干旱響應能力產生影響，與轉基因水稻抗旱能力降低一致。
　　綜上所述，本研究首先對OsESG1進