結(jié)腸腺瘤息肉病蛋白APC通過(guò)非完整Armadillo重復(fù)結(jié)構(gòu)與SMAP蛋白相互作用.pdf

1、結(jié)腸腺瘤息肉病是一種常染色體顯性遺傳性疾病。致病基因APC位于5q21染色體，整個(gè)cDNA編碼區(qū)長(zhǎng)度未8535bp，共有21個(gè)外顯子，其中第15號(hào)外顯子非常大，為6571bp。APC基因突變頻率較高，大約67％的結(jié)腸腺瘤息肉病患者可檢測(cè)到APC基因的突變。突變的發(fā)生不是隨機(jī)分布而是存在突變熱點(diǎn)，生殖細(xì)胞突變與體細(xì)胞突變分布方式存在一定的差別。點(diǎn)突變大多數(shù)為C→T的轉(zhuǎn)變，缺失多發(fā)生在有重復(fù)的核苷酸序列位置，以5個(gè)堿基的缺失最為多見(jiàn)，約占4

2、7％。APC蛋白有2843個(gè)氨基酸，分子量約為311.6kD。APC蛋白含有多個(gè)功能域，參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)?？傮w可分成三個(gè)部分：氨基端部分包含兩個(gè)功能域，寡聚功能結(jié)構(gòu)區(qū)和armadillo區(qū)；中央部分包含15個(gè)氨基酸重復(fù)區(qū)、20個(gè)氨基酸重復(fù)區(qū)和Axin結(jié)合區(qū)；羧基端部分含有EB1蛋白結(jié)合區(qū)域和hDLG結(jié)合位點(diǎn)。各個(gè)結(jié)構(gòu)域賦予APC蛋白不同的生物學(xué)功能。 APC作為一種腫瘤抑制蛋白參與Wnt信號(hào)途徑，主要是負(fù)調(diào)控β-cateni

3、n胞內(nèi)水平。APC蛋白與Axin、GSK-3和β-catenin等組成蛋白降解復(fù)合物，使β-catenin泛素化并最終降解。APC蛋白可以抑制Wnt信號(hào)途徑的非正常激活，從而防止結(jié)腸癌、黑色素瘤等腫瘤的發(fā)生。 APC蛋白的亞細(xì)胞定位還存在爭(zhēng)論，導(dǎo)致?tīng)?zhēng)論的一個(gè)關(guān)鍵因素是抗體。APC蛋白商業(yè)化抗體較多，已經(jīng)證實(shí)部分抗體存在明顯的非特異性反應(yīng)。利用特異性被證實(shí)的抗體發(fā)現(xiàn)大部分APC蛋白存在胞漿中。同時(shí)利用綠色熒光蛋白標(biāo)記的方法活體觀察

4、APC在爪蟾A6表皮細(xì)胞中的運(yùn)輸過(guò)程，實(shí)驗(yàn)非常清楚地觀察到APC蛋白沿微管正向運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域并定位在質(zhì)膜皮層下。 APC蛋白與細(xì)胞骨架的關(guān)系比較復(fù)雜，研究報(bào)道非常多，有的甚至出現(xiàn)截然相反的結(jié)論。在APC蛋白定位過(guò)程中，到底是微管起主要作用還是actin骨架網(wǎng)作用更大?這些問(wèn)題目前也存在爭(zhēng)論。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)在激光共聚焦顯微鏡下觀察到部分APC蛋白分布微管的末端，用藥物處理微管后，APC蛋白不能正常的定位到質(zhì)膜皮層下，因此微管

5、對(duì)APC蛋白的定位中起主要作用。 利用酵母雙雜交技術(shù)，以APC蛋白500-1600位氨基酸為誘餌，我們從人胎腦cDNA文庫(kù)中成功篩選到人SMAP蛋白。SMAP是小鼠Kap3在人類中的同源物，共792個(gè)氨基酸殘基，分子量約為91kD，含有9個(gè)armadillo重復(fù)結(jié)構(gòu)。我們制備了SMAP蛋白特異性的兔多克隆抗體，首先分析了SMAP蛋白在細(xì)胞和組織中的表達(dá)情況，證實(shí)它是一種廣泛表達(dá)的蛋白。接著我們又證實(shí)SMAP蛋白可以進(jìn)入細(xì)胞核。這

6、些情況都與已報(bào)到的SMAP定位情況類似。同時(shí)我們?cè)谛∈蠼M織勻漿液中利用免疫沉淀技術(shù)證實(shí)APC蛋白可以和SMAP蛋白共沉淀。反之，利用商業(yè)化的APC抗體也證明了二者可以共沉淀。接下來(lái)我們利用免疫激光共聚焦顯微鏡在未轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞這一自然狀態(tài)下分析了APC蛋白和SMAP蛋白的亞細(xì)胞定位，以及二者與細(xì)胞骨架蛋白actin和tubulin共定位情況，證實(shí)了APC部分蛋白可以定位在微管的生長(zhǎng)末端區(qū)域而SMAP蛋白則廣泛分布；雖然它們表達(dá)模式存在

7、一定差異，但是在細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)突起的地方可以很好的共定位。這也為解釋APC蛋白沿微管正向運(yùn)輸并定位膜下皮質(zhì)區(qū)并參與細(xì)胞粘附和細(xì)胞遷移提供了依據(jù)。 我們注意到APC蛋白armadillo重復(fù)區(qū)域共報(bào)道了4個(gè)互作蛋白，它們分別是SMAP/Kap3、Asef，PP2A，IQGAP1。我們用的誘餌是APC蛋白的500-1600aa這個(gè)片段，而后三者用的都是453-767aa片段。兩個(gè)片段含有500-767aa的重疊區(qū)域，因此我們將這一重疊區(qū)