IκBα超抑制蛋白基因轉(zhuǎn)染對(duì)急性肺損傷小鼠的治療作用.pdf

1、急性肺損傷(Acutelunginjury，ALI)是由感染等多種因素引起的以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的肺組織的炎癥反應(yīng)。以促炎因子/抗炎因子失衡為特征的過度全身炎癥反應(yīng)，是危重病患者發(fā)生急性肺損傷的重要機(jī)制。核因子-κB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)是炎癥相關(guān)多種細(xì)胞因子、黏附分子表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，NF-κB的活化與急性肺損傷發(fā)病關(guān)系密切，阻斷NF-κB活化有可能是治療急性肺損傷的重要手段。NF-κB抑

2、制蛋白(inhibitoryNF-κB，IκB)是NF-κB的特異性抑制物，研究表明，第32位和第36位絲氨酸發(fā)生突變的IκBα不會(huì)被降解，與NF-κB發(fā)生不可逆性結(jié)合，發(fā)揮超抑制屬性。本研究克隆了中國人IκBα基因，誘變、構(gòu)建NF-κB的超抑制物IκBαM重組腺病毒表達(dá)載體，觀察其對(duì)ALI中NF-κB抑制作用，為將來臨床應(yīng)用IκBα轉(zhuǎn)基因治療急性肺損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法： 1.應(yīng)用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)制備小鼠急性

3、肺損傷模型，凝膠滯留電泳法(EMSA法)檢測(cè)NF-κB在脂多糖誘發(fā)的急性肺損傷中的動(dòng)態(tài)表達(dá)。 2.應(yīng)用RT-PCR從外周血單核細(xì)胞克隆中國人IκBα基因，并對(duì)其S32和S36位絲氨酸密碼子進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建pShuttle/IκBαM真核表達(dá)載體。 3.在以上工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建Ad-IκBαM重組腺病毒載體。 4.在小鼠急性肺損傷模型中運(yùn)用Ad-IκBαM治療，通過ELISA、免疫組化等方法觀察基因治療對(duì)NF

4、-κB及炎性肺損傷的抑制作用。 研究結(jié)果： 1.NF-κB在脂多糖誘發(fā)的急性肺損傷中呈動(dòng)態(tài)表達(dá)。脂多糖腹腔注射后NF-KB表達(dá)在3小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰，隨后開始下降。 2.成功克隆了中國人IκBα基因，并對(duì)其S32和S36位絲氨酸密碼子進(jìn)行定點(diǎn)突變，進(jìn)一步構(gòu)建了Ad-IκBαM重組腺病毒表達(dá)載體。 3.腺病毒載體可以感染肺內(nèi)的主要細(xì)胞(肺泡上皮細(xì)胞)，并高效表達(dá)目的基因。 4.通過Ad-IκBαM轉(zhuǎn)基因