間接ELISA檢測(cè)林麝源銅綠假單胞菌抗體方法的建立及應(yīng)用評(píng)估.pdf

1、S i c h u a I l A g r i c u l t u r a lU n i V e r s 時(shí)D i s s e r t a t i o nS u b m i t t e di np a 而a l 如1 f l l l m e n t o f t h er e q u i r e m e n t f o rM a s t e rd e 掣e eE s t a b l i s h m e n t a n d a p p H

2、c a t i o ne V a l u a t i o no fi n d i r e c tE ：L I S A f b rd e t e c t i o na n t i b o d i e s a g a i n s tj b P “幽m D 廳嬲口盯昭脅口s 口f r o m 朋加幽淞b e r e 砷v s k 譴B yJ i a h u iR e nD i r e c t e d b yP r O f ．‰X i o n

3、gC h e n g d u ，6 11l3 0 ，S i c h u a n ，C h i n aJ u n e ．2 0 1 5．摘銅綠假單胞菌能引起林麝的化膿病，要該病病程緩慢、不易發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)后也難以治愈，給人工養(yǎng)殖林麝造成巨大損失。本試驗(yàn)旨在建立一種特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高的間接E L I s A 方法，為監(jiān)測(cè)林麝體內(nèi)的銅綠假單胞菌抗體水平，并為防控銅綠假單胞菌引起的林麝化膿性疾病提供幫助和指導(dǎo)。提取銅綠假單胞菌S p ．1

4、 株的外膜蛋白作為包被抗原。經(jīng)S D S ．P A G E 分析，提取的外膜蛋白有7 ～1 0 條帶，分子量在1 5k D a ~ 1 0 0 k D a 之間，是該菌的主要外膜蛋白。通過W e s t e mB l o m n g 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該外膜蛋白有4 條印跡條帶，分子量分別是4 6 k D a 、3 4 k D a 、2 5 k D a 和1 9 k D a ，可用作包被抗原。本試驗(yàn)建立的間接E u S A 方法的最佳條件：外膜

5、蛋白包被濃度為1 ．5 “鱸_ n l ；包被條件是3 7 ℃，溫箱孵育4h ；封閉條件為5 ％脫脂奶粉3 7 ℃作用2 h ；抗體稀釋倍數(shù)為1 0 0 0 倍，抗體與抗原作用條件為3 7 ℃孵育1 ．5h ；Ⅲ心一S P A 稀釋倍數(shù)為6 4 0 0 0倍，與抗體作用條件為3 7 ℃孵育1 ．5h ；刪B 作用條件為3 7 ℃顯色1 5 m i n 。用建立的間接E L I S A 方法檢測(cè)了大腸桿菌抗血清、沙門氏菌抗血清、不動(dòng)桿菌抗

6、血清和金黃色葡萄球菌抗血清，結(jié)果這四種菌的抗血清均判為銅綠假單胞菌抗體陰性；把S 口一1 株陽性血清用外膜蛋白處理后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，與未處理組相比，處理組O D 值顯著降低，阻斷率在6 3 ．6 9 ％～7 5 ．3 8 ％之間。經(jīng)板間重復(fù)試驗(yàn)和板內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，變異系數(shù)在2 ％r v l 0 ％之間。將本試驗(yàn)制備的銅綠假單胞菌s p 一1 株陽性血清倍比稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)稀釋至3 2 0 0 0 倍時(shí)，其P ／N 值&g

7、t; 2 ，結(jié)果仍判為陽性。用該方法檢測(cè)了3 0 份經(jīng)S p ．1 株免疫后的小鼠血清，效價(jià)達(dá)到1 ：1 2 5 0 0 、1 ：2 5 0 0 、1 ：5 0 0 和1 ：1 0 0 的分別有1 3 份、7 份、2 份和2 份，低于1 ：l o o 的有6 份。同時(shí)，檢測(cè)了2 0 1 4 年1 0 月份和1 1 月份采集的林麝血清樣品3 2 份，有4 份血清判為陽性，其余判為陰性。本試驗(yàn)建立的檢測(cè)林麝銅綠假單胞菌抗體的間接E L I