健脾化濕通絡(luò)法對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控研究.pdf

1、1.目的：
　　 以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，總結(jié)分析類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫(NEI)網(wǎng)絡(luò)的變化及中醫(yī)藥對其影響；通過動物實驗，研究佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠神經(jīng)遞質(zhì)、下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能、血管神經(jīng)肽、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及Foxp3表達(dá)的變化及健脾化濕通絡(luò)法其影響，基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對上述研究結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)分析，全面揭示健脾化濕通絡(luò)法對AA大鼠NEI網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用及可能機制，豐富RA“從脾論治，整體調(diào)節(jié)”的科學(xué)內(nèi)涵，為

2、中醫(yī)藥治療RA的機理研究提供新思路。
　　 2.方法：
　　 2.1理論研究
　　 通過文獻(xiàn)研究，總結(jié)分析中醫(yī)理論與NEI網(wǎng)絡(luò)學(xué)說的關(guān)系，闡述RANEI網(wǎng)絡(luò)的變化及中醫(yī)健脾法對其影響。
　　 2.2實驗研究
　　 將84只Wistar雄性大鼠按隨機數(shù)字表分為7組：正常對照組、模型對照組、甲氨喋呤(MTX)組、雷公藤多甙片(TPT)組和新風(fēng)膠囊(XFC)高、中、低劑量組，每組12只，除正常對照組外，

3、向每只動物右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1ml致炎，復(fù)制AA大鼠模型。致炎后第19天開始給予相應(yīng)藥物治療30 d。觀察各組大鼠的體質(zhì)量、足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)；酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組大鼠血清5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(CORT)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-10(IL-10)，內(nèi)皮素-1(ET-1)和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)含量及腦組織ET-1、CGRP含量；流式細(xì)胞術(shù)檢

4、測大鼠血液CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)頻率；免疫組化法檢測下丘腦糖皮質(zhì)激素受體(GR)蛋白表達(dá)；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測下丘腦促腎上腺激素釋放激素(CRH)mRNA表達(dá)，大腦皮質(zhì)GR mRNA表達(dá)及脾臟細(xì)胞Foxp3mRNA表達(dá)；免疫印跡法檢測大鼠胸腺組織Foxp3蛋白表達(dá)水平。
　　 3.結(jié)果：
　　 3.1理論研究結(jié)果
　　 NEI網(wǎng)絡(luò)學(xué)說與中醫(yī)理論關(guān)系緊密，NEI網(wǎng)絡(luò)的雙向調(diào)節(jié)和動態(tài)平衡是中醫(yī)陰陽平

5、衡理論及整體觀念的重要體現(xiàn)，NEI網(wǎng)絡(luò)在RA發(fā)病中發(fā)揮重要作用，而中醫(yī)脾臟是NEI網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)中樞，中醫(yī)健脾法通過調(diào)整NEI網(wǎng)絡(luò)平衡發(fā)揮對RA的綜合治療作用。
　　 3.2實驗研究結(jié)果
　　 3.2.1健脾化濕通絡(luò)法對AA大鼠的療效分析
　　 健脾化濕通絡(luò)中藥新風(fēng)膠囊治療組AA大鼠的體質(zhì)量增長顯著高于模型對照組、MTX組及TPT組，與正常對照組無顯著差異(P＞0.05)，MTX組及TPT組體質(zhì)量增長顯著低于正常對照

6、組(P＜0.01)；新風(fēng)膠囊治療組AA大鼠足跖腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著低于模型對照組(P＜0.01，或P＜0.05)，與其余各治療組間無明顯差異(P＞0.05)。
　　 3.2.2健脾化濕通絡(luò)法能抑制AA大鼠神經(jīng)遞質(zhì)5-HT分泌
　　 研究結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組大鼠血清5-HT水平顯著升高(P＜0.01)，各治療組5-HT水平均有所下降，組間比較顯示XFC組下調(diào)作用更為明顯(P＜0.01)，各組DA水平無顯著變

7、化。
　　 3.2.3健脾化濕通絡(luò)法能調(diào)整AA大鼠HPA軸功能紊亂
　　 研究結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組大鼠血清ACTH、CORT水平及大腦皮質(zhì)GRmRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.01，或P＜0.01)，下丘腦CRHmRNA表達(dá)降低(P＜0.01)；與模型組比較，新風(fēng)膠囊組能有效下調(diào)AA大鼠血清ACTH及CORT水平，下調(diào)AA大鼠大腦皮質(zhì)GRmRNA表達(dá)，上調(diào)下丘腦CRHmRNA表達(dá)，作用顯著優(yōu)于MTX和TPT組(

8、P＜0.01，或P＜0.01)。
　　 3.2.4健脾化濕通絡(luò)法能降低TNF-α水平，促進(jìn)IL-10分泌
　　 研究結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型對照組大鼠TNF-α顯著升高，IL-10值降低(P＜0.01或P＜0.01)；與模型對照組相比，XFC、MTX、TPT組均能降低TNF-α(P＜0.01)，升高IL-10(P＜0.01)；各治療組相比，XFC組在降低TNF-α，升高IL-10方面優(yōu)于MTX組和TPT組(P＜0

9、.01或P＜0.01)。
　　 3.2.5健脾化濕通絡(luò)法能調(diào)節(jié)AA大鼠血管活性肽ET-1、CGRP水平
　　 研究結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組大鼠血清及腦組織中ET-1含量明顯升高(P＜0.01)，CGRP含量明顯降低(P＜0.01)；與模型組比較，各治療組均能顯著降低ET-1水平，升高CGRP水平(P＜0.01)，XFC中、高劑量組降低ET-1，升高CGRP作用明顯優(yōu)于MTX和TPT組(P＜0.01，或P＜0.0

10、1)。
　　 3.2.6健脾化濕通絡(luò)法能上調(diào)CD4+CD25+Treg比例，促進(jìn)Foxp3表達(dá)
　　 研究結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組大鼠CD4+CD25+Treg比例明顯下降(P＜0.01)，脾臟Foxp3mRNA及胸腺Foxp3蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.01)；與模型組比較，XFC中、高劑量組能明顯增加大鼠CD4+CD25+Treg比例(P＜0.01)，升高胸腺Foxp3蛋白表達(dá)(P＜0.01)，明顯優(yōu)于MTX

11、組和XFC低劑量組(P＜0.01，或P＜0.01)。
　　 3.2.7NEI網(wǎng)絡(luò)檢測指標(biāo)的分層聚類分析
　　 分層聚類分析結(jié)果表明，全部檢測指標(biāo)分為兩大類，在AA模型中表現(xiàn)為升高的CORT、TNF-α、5-TH、ACTH、組織ET、AI、ET-1、Treg、GRmRNA、關(guān)節(jié)腫脹度、DA等11項指標(biāo)優(yōu)先聚合，在這些指標(biāo)中CORT、TNF-α、5-TH三者關(guān)系最為緊密；在AA模型中表現(xiàn)為降低的CGRP、胸腺Foxp3、IL

12、-10、脾臟Foxp3、組織CGRP、CRH等6項指標(biāo)再聚合，在這6項指標(biāo)中CGRP、IL-10、胸腺及脾臟Foxp3表達(dá)關(guān)系最為緊密。這表明，在評價NEI網(wǎng)絡(luò)各指標(biāo)的變化時，可在兩大類指標(biāo)中選擇具有較強相關(guān)性的指標(biāo)即可，其效果與檢測全部指標(biāo)基本是等價的，但更經(jīng)濟(jì)快捷，易于發(fā)現(xiàn)各指標(biāo)間的變化規(guī)律。
　　 4.結(jié)論：
　　 4.1NEI網(wǎng)絡(luò)學(xué)說與中醫(yī)理論關(guān)系緊密
　　 NEI網(wǎng)絡(luò)的雙向調(diào)節(jié)和動態(tài)平衡是中醫(yī)陰陽平衡理

13、論及整體觀念的重要體現(xiàn)，NEI網(wǎng)絡(luò)在RA發(fā)病中發(fā)揮重要作用，而中醫(yī)脾臟是調(diào)節(jié)NEI網(wǎng)絡(luò)的重要中樞，中醫(yī)健脾法能從多靶點、多環(huán)節(jié)、多層次、多途徑對RA發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用。
　　 4.2AA大鼠存在NEI網(wǎng)絡(luò)功能紊亂
　　 AA大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂主要表現(xiàn)為神經(jīng)遞質(zhì)5-HT水平顯著升高；內(nèi)分泌系統(tǒng)功能紊亂主要表現(xiàn)為血清ACTH、CORT水平及大腦皮質(zhì)GRmRNA表達(dá)顯著升高，下丘腦CRHmRNA表達(dá)降低；血管活性肽ET-1含量

14、明顯升高，CGRP含量明顯降低；免疫系統(tǒng)功能紊亂主要表現(xiàn)為致炎細(xì)胞因子TNF-α升高，抑炎細(xì)胞因子IL-10降低；CD4+CD25+Treg下降，脾臟Foxp3mRNA及胸腺Foxp3蛋白表達(dá)明顯降低。
　　 4.3健脾化濕通絡(luò)法對AA大鼠NEI網(wǎng)絡(luò)顯示出良好的調(diào)控作用
　　 健脾化濕通絡(luò)中藥新風(fēng)膠囊能有效降低AA大鼠足跖腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)，對大鼠體質(zhì)量無不良影響；新風(fēng)膠囊能抑制AA大鼠神經(jīng)遞質(zhì)5-HT分泌，有效下調(diào)AA

15、大鼠血清ACTH及CORT水平，下調(diào)AA大鼠大腦皮質(zhì)GRmRNA表達(dá)，上調(diào)下丘腦CRHmRNA表達(dá)，從下丘腦或更高層的中樞結(jié)構(gòu)維持HPA軸環(huán)路穩(wěn)態(tài)；降低TNF-α水平，促進(jìn)IL-10分泌，維持細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡；降低ET-1水平，升高CGRP水平；上調(diào)CD4+CD25+Treg比例，促進(jìn)脾臟Foxp3mRNA及胸腺Foxp3蛋白表達(dá)。
　　 4.4基于NEI網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的健脾化濕通絡(luò)法治療AA大鼠的作用機制
　　 4.4.1健

16、脾化濕通絡(luò)法能降低外周神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的釋放，減少5-HT的致痛效應(yīng)，減輕關(guān)節(jié)癥狀。
　　 4.4.2健脾化濕通絡(luò)法能有效下調(diào)AA大鼠血清ACTH及CORT水平，下調(diào)AA大鼠大腦皮質(zhì)GRmRNA表達(dá)，上調(diào)下丘腦CRHmRNA表達(dá)，從下丘腦或更高層的中樞結(jié)構(gòu)維持HPA軸環(huán)路穩(wěn)態(tài)，抑制炎癥反應(yīng)。
　　 4.4.3健脾化濕通絡(luò)法通過調(diào)節(jié)血管活性肽ET-1與CGRP的平衡，調(diào)整關(guān)節(jié)滑膜新生血管的舒縮功能，改善關(guān)節(jié)局部血管功能障礙