殺傷細胞免疫球蛋白樣受體基因多樣性與強直性脊柱炎的相關性研究.pdf

1、立題依據(jù)和目的 血清陰性脊柱關節(jié)病(spondyloarthropathy，SpA)是一組累及脊柱、周圍關節(jié)及其周圍軟組織的風濕性疾病。關節(jié)病變除有疼痛外尚伴有腫脹和活動障礙，呈發(fā)作與緩解交替的慢性炎癥過程，嚴重者可出現(xiàn)關節(jié)致殘和內臟功能衰竭。SpA包括強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，As)、反應性關節(jié)炎和Rei．te綜合征、銀屑病關節(jié)炎、炎性腸病關節(jié)炎、幼年起病脊柱關節(jié)病等。其中以AS最常見，并具有

2、代表性。該病起病隱匿而緩慢，發(fā)病年齡多在15-30歲，男性多于女性且男性患者的癥狀遠較女性重。AS的患病率在各國報道不一，我國患病率初步調查為0.26％。其發(fā)病機制至今不明，流行病學調查發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病機制涉及了遺傳易感基因和環(huán)境因素、感染因素的共同作用。目前有很多學者將AS劃歸全身性自身免疫性疾病。AS有明顯的家族聚集傾向，AS家庭中一級親屬患AS的概率在2.4％左右，本病另一重要特點是與人類白細胞抗原B27(HLA-B27)強相關，這種

3、關聯(lián)在已知HLA與疾病的關聯(lián)性中最強，相對危險值高達81.8，HLA-B27陽性者患AS的概率較HLA-1327陰性者高20-40倍。關聯(lián)分析和轉基因動物模型研究都提示HLA-B27抗原是引起此類炎癥性疾病最主要的危險因素，將HLA-B27基因轉至大鼠，可導致轉基因大鼠發(fā)生強直性脊柱炎。家系和雙生子資料表明除HLA-B27以外，還有其他遺傳基因參與該病的發(fā)生，說明As應歸屬于多基因遺傳病，在遺傳易感的基礎上，由環(huán)境因素或/和感染因素觸發(fā)

4、和促進自身免疫反應的發(fā)生。AS患者在多個層面存在細胞免疫功能紊亂，其體內存在著TH1/TH2平衡的偏移，TH1激活程度低下，而TH2激活程度增強，細胞因子水平的改變尤以TH1細胞因子TNF-a降低特別明顯。 自然殺傷細胞(N K)是機體免疫系統(tǒng)抗腫瘤和病毒感染的第一道防線，同時又能通過早期分泌多種細胞因子來調節(jié)獲得性免疫應答。在免疫應答中，N K細胞受體承擔著識別靶細胞的功能，監(jiān)控細胞MHC分子的正確裝配，NK細胞表面受體一旦識

5、別其相應的HLA-I配基特定的氨基酸殘基，產(chǎn)生活化或抑制信號，將導致靶細胞裂解或抑制細胞裂解。已知KIR2D分子的配體為HLA-Cw，KIR分子中2DL1/2DS1特異性識別位點是位于HLA-Cw*02，04，05，06分子α重鏈上第80位的賴氨酸。2DL2/2DL3、2DS2/2DS3特異性識別Cw*01，03，07，08分子α重鏈上第80位的氨基酸為天冬氨酸。KIR與HLA均為共顯性表達，而且KIR的表達強度不受HLA的影響。因此，

6、KIR和HLA在DNA水平和蛋白質水平是一致的。個體的KIR和HLA表型決定了個體NK細胞與自身組織細胞間的作用方式。 NK細胞發(fā)育的正常過程確保循環(huán)中的NK細胞對自身健康細胞的耐受，這種狀態(tài)依靠NK細胞受體與自身HLA-I類分子配體的相互作用。NK細胞受體分為兩個家族：免疫球蛋白樣受體家族和C型凝集素(C-lectin)受體家族。前者包括殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(Killer cell Ig-like receptors，KI

7、Rs)，白細胞免疫球蛋白樣受體(Leukocyte immunoglob μlin-like recep-tors，LILR)，白細胞相關抑制受體(Leukocyte-associated inhibitory receptors。LAIR)和NK細胞活化受體NKp46。KIRs由位于染色體19q13.4上的跨距約150 kb、“頭尾排列”、聚集成簇和多態(tài)性豐富的多基因家族編碼，迄今發(fā)現(xiàn)KIR基因家族有14個KIR基因和2個假基因。KI

8、Rs是繼HLA后發(fā)現(xiàn)的具有高度多態(tài)性的免疫調節(jié)基因家族，主要存在于NK細胞和部分CD8*T細胞表面，能與主要組織相容性復合體(MHC)和/或非MHC類配體結合，通過介導免疫效應細胞(NK細胞和T細胞)的抑制或活化信號，參與機體先天性和獲得性抗腫瘤免疫、抗感染免疫、抗病毒免疫應答、母胎耐受、免疫監(jiān)視和免疫耐受的調節(jié)。KIR根據(jù)功能分為抑制性和活化性兩類受體。KIRs的膜外區(qū)有免疫球蛋白(Ig)樣結構域，屬于免疫球蛋白超家族。KIRs具有遺

9、傳多態(tài)性，不同地區(qū)、不同種族和不同個體、不同NK細胞克隆，KIRs的表達格局、基因數(shù)目均存在差異，而且KIR的多態(tài)性還表現(xiàn)在同-KIR基因座位包含多個等位基因，類似于HLA-DR的基因多態(tài)性。雖然KIRs在NK細胞和T細胞上的表達是克隆性的，但個體的基因型是其表達的決定性因素。 近年來，KIR基因與感染性疾病和自身免疫性疾病遺傳易感性的的關系以及KIR與HLA-CW組成免疫抑制信號傳導系統(tǒng)在免疫調節(jié)中發(fā)揮的作用引起人們的關注。研

10、究發(fā)現(xiàn)，抑制性/活化性KIRs基因的失衡可能和I型糖尿病、銀屑病性關節(jié)炎等自身免疫病相關。為探討KIRs及HLA-Cw在AS發(fā)病中的作用，本研究采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(PCR-SSP)基因分型技術分析AS患者KIRs基因及HLA-Cw等位基因，由KIR基因型推斷單倍型，計算KIRs基因頻率、抑制性和活化性KIR基因數(shù)目，同時以正常人群做對照，探討KIRs以及其相應的配體HLA-Cw等位基因基因多態(tài)性與AS和的相關性。 資

11、料與方法 1、臨床資料篩選山東省立醫(yī)院風濕免疫科門診和住院As患者86例作為研究組，所有病例符合1985年全國部分省市中西醫(yī)結合風濕病學術座談會制定的診斷標準，且HLA-B27陽性。年齡8~68歲，其中，男71例，女15例。正常對照412例，為山東省立醫(yī)院健康查體的無血緣關系的隨機個體、山東省和濟南市中心血站自愿獻血者。對照組無自身免疫性疾病，年齡10~70歲，其中，男260例，女152例。 2．研究方法 2．1

12、基因組DNA抽提As病例和健康對照均取靜脈血5ml，EDTA-K2防凝，-20℃保存。用本室研制DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，-20℃保存。 2．2 KIR基因序列特異性引物聚合酶鏈式反應(sequence-specific primerpolymerase chain reaction，PCR/SSP)參照文獻及IHWG推薦的引物序列，共合成30對引物，由上海博亞生物工程有限公司合成，用PCR/SSP方法進行KIR基因

13、頻率檢測。HLA-Cw參照文獻共合成引物13對，分別檢測HLA-Cw*01-08等位基因。 2．3對照以KIR框架基因3DL2、3DL3、2DL4為陽性對照，以不含DNA的PCR體系作陰性對照。 2．4結果判斷PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳成像儀觀察泳帶并保存圖象。根據(jù)電泳的結果，對患者組和對照組人群KIR基因的基因頻率、基因型頻率及HLA-Cw等位基因頻率進行分析比較。 2．5統(tǒng)計學方法：每個KI

14、R基因及HLA-Cw等位基因頻率出現(xiàn)頻率(pf,％)通過計數(shù)測得，pf(％)=基因陽性數(shù)/N×％(N為研究組例數(shù))；基因頻率(genefrequency，GF)計算公式為：GF=1-平方根(1一pf)；KIR單倍型頻率(haplotypefrequency)=單倍型陽性數(shù)/2N(N為研究組例數(shù))?；颊呓M與正常對照組間差異顯著性用SPSS軟件計算。 結果： 3．1與正常對照人群相比，AS患者活化性基因KIR3DS1出現(xiàn)頻率

15、和基因頻率顯著增高(P<0.05)，其他KIR基因位點頻率差異無統(tǒng)計學意義。 3．2活化性KIR基因數(shù)量和AS相關性：攜帶2個或2個以上活化性KIR的個體在AS患者組占77.91％，在對照組占33.7496，而攜帶1個活化性KIR的個體AS組占22.09％，在對照組占66.26％，兩者差異具有顯著性(P<0.05)。 結論： 1) KIR基因失衡可能和AS的免疫病理有關： 攜帶2個及2個以上活化性KIR基

16、因的AS患者明顯高于對照組，致使抑制性和活化性KIR受體的失衡，可能降低了NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞的活化閾值，對自身組織產(chǎn)生免疫應答。 2) 在特異性配體HLA-Cw-Lys<'80>存在時，KIR2DS1可能是AS的一個易感基因。 3) KIR3DS1可能是是AS的一個易感基因。 本研究提示KIR基因及其配體HLA-Cw等位基因平衡紊亂有可能打破NK細胞和/或T細胞受體平衡，使NK細胞和/或T細胞功能異常而