人強直性脊柱炎相關(guān)基因的克隆及分析.pdf

1、研究背景：強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種主要累及脊椎等中軸關(guān)節(jié)和肌腱、韌帶骨附著點的慢性炎性疾病，可引起脊柱骨性強直甚至中軸關(guān)節(jié)的活動功能喪失，導致嚴重的殘疾。AS在中國人群中的發(fā)病率約為0.2％，患者多為青壯年，給患者及家庭帶來沉重負擔。有文獻報道HLA-B27、TNF-α、白介素家族、KIR基因家族與AS 關(guān)聯(lián)，但AS 發(fā)病的具體分子機制尚不清楚。現(xiàn)有的治療措施難以獲得滿意的療效，因此解析A

2、S 發(fā)病的分子機制成為有效開展AS 治療的關(guān)鍵。
　　 目的：應用表達譜芯片從AS患者的椎間組織中篩選組織差異表達基因，應用抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建AS組織差異基因的消減cDNA文庫，獲得AS 相關(guān)基因序列，為克隆基因全長進行基因功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：采用改良RNAiso Plus 法從AS患者椎間組織中提取總RNA作為實驗組，以未患AS的骨折患者椎間組織總RNA為對照組，制備實驗組和對照組探針分別與表達譜芯片進行

3、雜交。實驗組和對照組芯片雜交結(jié)果掃描后進行比較，篩選出差異表達基因。以AS 標本RNA為Test er，以骨折標本RNA為Driver，逆轉(zhuǎn)錄制備雙鏈cDNA。RsaI 酶切雙鏈cDNA后在兩組Test er兩端分別連接不同接頭，將帶接頭的Test er與Driver 進行兩輪消減雜交。雜交產(chǎn)物作為模板進行巢式PCR，擴增獲得消減cDNA。消減cDNA 進行T/A 克隆后PCR 檢測排除假陽性，構(gòu)建消減cDNA文庫。將消減cDNA文庫樣

4、本進行測序，拼接序列后獲得AS組織高表達基因。結(jié)合文獻分析表達譜芯片和SSH 結(jié)果，選擇有價值的基因作為AS 候選基因，RT-PCR 驗證其在AS組織和骨折組織中的表達。
　　 結(jié)果：成功提取獲得高質(zhì)量的椎間組織總RNA，完整性和純度達到后實驗要求。表達譜芯片篩選獲得237 條AS組織差異基因，篩選出20條作為AS 候選基因，RT-PCR檢測表明其在AS組織和對照組中的表達情況與芯片結(jié)果基本一致。采用抑制差減雜交成功構(gòu)建含182

5、個差異基因片段的消減cDNA文庫，測序后拼接獲得32 條AS 候選基因，其中8 條基因確定為AS 相關(guān)基因，包括5 條已知基因和3 條未知基因。RT-PCR檢測8 條基因全部為在AS組織高表達的差異基因。
　　 結(jié)論：采用改良RNAiso Plus 法提取椎間組織總RNA，可以有效去除蛋白多糖從獲得高質(zhì)量總RNA。采用表達譜芯片成功獲得237個AS組織差異基因，采用抑制差減雜交成功構(gòu)建消減cDNA文庫。芯片結(jié)果中篩選到20條AS