蜂膠預(yù)防根面齲作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 根面齲是老年人的口腔常見(jiàn)病，老年患齲率為73.0％，充填率30.6％，且根面齲多于冠面齲?；箭x老年人群中只有30％接受治療，70％未接受治療。因此，根齲病是老年口腔疾病防治的重要內(nèi)容之一。在菌斑細(xì)菌的作用下，牙骨質(zhì)表層下無(wú)機(jī)物脫礦，有機(jī)物分解，牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)和完整性遭到破壞軟化成根齲。關(guān)于根面齲致病菌的觀點(diǎn)至今仍有分歧。對(duì)致齲微生物生物學(xué)特性的研究結(jié)果，提示變形鏈球菌是最重要的致齲菌，對(duì)根面齲的發(fā)生起協(xié)同作用。早期采用的抗生

2、素、氟化物防齲等在臨床應(yīng)用上有諸多局限性，尚需要探討一些新的有效的預(yù)防方法。蜂膠成分非常復(fù)雜。其中，以黃酮類的含量最高，也是蜂膠的精華所在，約占萃取物的40％-50％。人們發(fā)現(xiàn)它具有多種藥理活性，包括抗氧化活性、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤作用。目前蜂膠在治療口腔粘膜病、防治牙周病中效果明顯。蜂膠失活牙髓、消毒牙根管對(duì)口腔軟硬組織無(wú)任何副作用。亦可用于皮膚科、婦科、消化內(nèi)科等多種疾病的治療中，適用范圍廣泛。本文將探討蜂膠防齲效果及其

3、可能的防齲機(jī)制，為蜂膠在預(yù)防根面齲臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1 菌懸液的制備：將復(fù)蘇48h的變形鏈球菌種于羊血培養(yǎng)基微需氧條件下37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。挑選菌落，傳代培養(yǎng)3次，涂片檢查細(xì)菌生長(zhǎng)良好，確定為變形鏈球菌后將細(xì)菌轉(zhuǎn)種于牛心湯培養(yǎng)液中。微需氧環(huán)境37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)。使用紫外分光光度計(jì)用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整為OD=1.0的菌懸液用于實(shí)驗(yàn)。 2 蜂膠醇溶液(propolis’s solution簡(jiǎn)稱：P

4、’s)的制備：將100g/L醇溶性北京蜂膠提取物按1:2的梯度逐級(jí)成倍稀釋，即制備7.5g/L，3.75g/L，1.875g/L三種濃度蜂膠醇溶液。 3 體外抑菌實(shí)驗(yàn)：采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，使用卡尺測(cè)量每組試劑周圍抑菌環(huán)大小。每個(gè)試劑組作5份標(biāo)本。 4 收集因牙周病導(dǎo)致的Ⅲ度松動(dòng)磨牙40顆，體視顯微鏡下觀察(放大10倍)無(wú)裂痕缺隙，無(wú)根面齲壞，刮除牙結(jié)石及根面牙周膜。用0.1mol/L PBS液在超聲清洗器內(nèi)清洗5min，

5、干燥，置10％甲醛溶液中消毒4℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有牙用金剛砂盤從中央窩處沿頰舌向面縱向剖開，以牙冠近(遠(yuǎn))中側(cè)作為試驗(yàn)區(qū)。從釉牙骨質(zhì)界下1mm制成7mm×7mm的牙骨質(zhì)塊，去離子水超聲清洗12min，吹干試驗(yàn)區(qū)中部暴露形成5mm×5mm的實(shí)驗(yàn)開窗區(qū)。其余部位涂布指甲油。將預(yù)備好的牙骨質(zhì)塊隨機(jī)分成5組(每組15個(gè)標(biāo)本)。開窗區(qū)分別用7.5g/L，3.75g/L，1.875g/L三種濃度蜂膠醇溶液以及20g/L氟化鈉溶液，去離子水(deio

6、nized water簡(jiǎn)稱D'w)浸泡約5min，自然涼放30min后，放回37℃人工唾液恒溫水浴，每天3次，每組各于5d、10d、15d隨機(jī)取出5個(gè)標(biāo)本去離子水沖洗處理4min室溫下干燥。將7.5g/L P’s，3.75g/L P’s，18.75g/L P’s，20g/L NaF，D’w處理過(guò)的牙標(biāo)本分別懸吊上述菌液2ml中在微需氧條件下培養(yǎng)48h后取出，脫礦液留作原子吸收分光光度計(jì)測(cè)Ca<'2+>溶出量。 5 掃描電子顯微鏡

7、觀察：用高速金剛砂盤噴水條件下將脫礦15d后，7.5g/L P’s處理過(guò)的牙標(biāo)本每個(gè)樣本于開窗中分切成兩半，一半牙骨質(zhì)塊立即放入2.5％戊二醛內(nèi)預(yù)固定24h，1％鋨酸內(nèi)后固定2h。用PBS緩沖液漂洗，50％至無(wú)水乙醇逐級(jí)脫水干燥后鍍金膜，掃描電鏡觀察標(biāo)本并拍照。 6光鏡觀察：將剩余脫礦牙標(biāo)本以4％多聚甲醛溶液固定24h，10％EDTA溶液常規(guī)脫鈣，以平行牙體長(zhǎng)軸為標(biāo)準(zhǔn)做近遠(yuǎn)中向連續(xù)組織切片，行HE染色，觀察標(biāo)本并拍照。 結(jié)果：

8、 (1) 隨蜂膠濃度降低，抑菌環(huán)直徑變小。7.5g/L P’s組，3.75g/L P’s組直徑分別為15.36±0.60mm，12.40±0.47mm。濃度1.875g/L時(shí)，仍有明顯抑菌環(huán)，與95％乙醇組4.10±0.49mm比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)脫礦和鈣溶出量測(cè)定結(jié)果：蜂膠醇各濃度組均有抑制牙骨質(zhì)脫礦的作用。作用5天的各濃度組與D’w組相比，牙骨質(zhì)Ca<'2+>溶出量差異均具有高度顯著性(P<0.01)，且隨著蜂膠濃度的

9、增加脫礦量也隨之減少。與氟化鈉組相比，除1.875g/L P’s組牙骨質(zhì)Ca<'2+>溶出量無(wú)顯著性差異(P>0.05)外，其余各實(shí)驗(yàn)組的脫礦作用差異均具有高度顯著性(P<0.01)。作用10天各濃度組與D’w組相比，牙骨質(zhì)脫礦量差異均具有顯著性(P<0.01)，且隨著蜂膠濃度的增加脫礦量也隨之減少。與氟化鈉組相比，除1.875g/L P’s組脫礦量差異有顯著性(P<0.05)外，其余各組對(duì)牙骨質(zhì)的脫礦作用差異均具有高度顯著性(P<0.

10、01)。作用15天的各濃度組與D’w組及氟化鈉組相比，Ca<'2+>溶出量差異均具有高度顯著性(P<0.01)。相同濃度蜂膠作用時(shí)間越長(zhǎng)脫礦量越少。(3)齲損深度在7.5g/L蜂膠組中最小33.27±10.37μm，空白組中最大116.92±17.94μm。各處理組與空白組間差異具有高度顯著性(P<0.01)。蜂膠各濃度組除1.875g/L組與氟化鈉組間差異無(wú)顯著性(P>0.05)，其余各組與氟化鈉組有非常顯著性差異(P<0.01)。表

11、層厚度各組與對(duì)照組間差異均存在顯著性差異(P<0.01)。(4)掃描電鏡觀察：在去離子水組人工齲表面脫礦明顯有大小不等的孔穴，呈典型的蜂窩狀，牙骨質(zhì)羥磷灰石晶體溶解基質(zhì)內(nèi)含大量細(xì)菌。氟化鈉組：人工齲表面形態(tài)改變類似于去離子組，可見(jiàn)大小不等的孔穴表面下結(jié)構(gòu)紊亂。蜂膠組：蜂膠組脫礦實(shí)驗(yàn)后與脫礦實(shí)驗(yàn)前相比牙骨質(zhì)表面形態(tài)改變較少。高倍鏡下未見(jiàn)明顯酸蝕孔或開放的牙本質(zhì)小管口。(5)光鏡下改變各組牙骨質(zhì)層均出現(xiàn)脫礦區(qū)，但病損深度以對(duì)照組為重，對(duì)照組

12、齲損區(qū)域呈一個(gè)三角形病變外觀，表層很薄，表層下脫礦區(qū)域?qū)?。光鏡下，可見(jiàn)部分牙本質(zhì)小管擴(kuò)張，擴(kuò)張的小管可排列呈串珠狀。部分小管相互融合形成大小不等的壞死灶。周圍組織間界限不清。氟化鈉組：牙齒表現(xiàn)為表層增厚，表層下脫礦區(qū)域變窄，波及牙本質(zhì)淺層。蜂膠組：表層致密，鏡下可見(jiàn)輕微齲損，其脫礦區(qū)與正常組織間界限明顯。牙本質(zhì)層基本保持結(jié)構(gòu)完整，鏡下可見(jiàn)通于牙本質(zhì)全層的管狀空間和成牙本質(zhì)細(xì)胞突起。 結(jié)論： (1)蜂膠醇溶液能明顯抑制變形