殼聚糖納米包裹強化IL-2與Tp92核酸疫苗聯(lián)合免疫的免疫保護性實驗研究.pdf

1、目的:研究白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)基因DNA疫苗與梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)Tp92抗原編碼基因DNA疫苗用殼聚糖納米顆粒(chitosan nanoparticles,CS)包裹聯(lián)合免疫新西蘭兔后免疫應答效應以及對新西蘭兔的感染后的保護作用。
　　方法:定向克隆構(gòu)建真核表達重組體 pcDNA3.1(+)/Tp92和pcDNA3.1(+)/IL-2;用CS納米顆粒包裹后肌

2、肉多點注射聯(lián)合免疫新西蘭兔,每隔2w加強一次共3次,并于初次免疫后第8w每組隨機取3只兔無菌分離脾細胞培養(yǎng), MTT法檢測兔脾淋巴細胞增殖水平,ELISA試劑盒檢測脾細胞培養(yǎng)上清IL-2及IFN-γ誘導水平;第10w各實驗組兔皮下接種TpNichols標準株進行皮膚感染實驗,觀察記錄感染早期各實驗組及對照組皮損的變化情況,在免疫及感染期間不同時間點分別采用ELISA檢測免疫兔特異性Tp92抗體產(chǎn)生水平,MTT法檢測兔脾淋巴細胞增殖水平。

3、同時在感染后0-48d期間每隔3d觀察記錄感染部位皮損Tp陽性率及潰瘍病灶發(fā)生率。
　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/Tp92和pcDNA3.1(+)/IL-2經(jīng)酶切和測序鑒定證實插入片段為目的基因,測序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一致;均能在HeLa細胞內(nèi)有效表達靶蛋白。
　　2. pcD/IL-2基因佐劑的聯(lián)合使用對pcD/Tp92疫苗在兔體內(nèi)誘生Tp92特異性抗體有顯著促進作用(

4、P<0.05);CS對pcD/Tp92疫苗的包裹對誘生Tp92特異性抗體有顯著促進作用(P>0.05)。
　　3.pcD/IL-2基因佐劑的聯(lián)合使用對pcD/Tp92疫苗在兔體內(nèi)促進IL-2及IFN-γ分泌有著顯著的加強作用(P<0.05);CS納米顆粒對pcD/Tp92疫苗的包裹并未能顯著促進IL-2及IFN-γ的分泌(P>0.05)。
　　4. pcD/IL-2基因佐劑的聯(lián)合使用對pcD/Tp92在兔體內(nèi)促進T細胞增殖分

5、化有著明顯的加強作用;CS納米顆粒包裹核酸疫苗后較相應未包裹核酸疫苗組并未能顯著促進T細胞增殖分化。
　　5. Tp的兔皮膚感染導致感染期內(nèi)各對照組Tp92特異性抗體水平有著顯著升高,對各疫苗組Tp92特異性抗體水平產(chǎn)生有一定刺激作用;pcD/IL-2基因佐劑對pcD/Tp92在感染期兔體內(nèi)Tp92特異性抗體水平的長久促進及維持有顯著作用,而CS納米顆粒的包裹對pcD/Tp92在感染期后階段兔體內(nèi)Tp92特異性抗體水平的長久促進及

6、維持無顯著作用。
　　6. Tp的兔皮膚感染導致感染期內(nèi)各對照組脾細胞的增殖分化有著顯著升高,對疫苗組脾細胞的增殖分化有一定促進;pcD/IL-2基因佐劑的聯(lián)合使用對pcD/Tp92在感染期兔體內(nèi)脾細胞的增殖水平的長久促進及維持的有顯著作用,而CS納米顆粒的包裹對pcD/Tp92在感染期兔體內(nèi)脾細胞的增殖水平的長久促進及維持無顯著作用。
　　7.各疫苗相比各對照組均能顯著降低Tp感染部位皮損Tp陽性率及潰瘍病灶形成率,顯示出

7、較強的免疫保護效應;pcD/IL-2基因佐劑較之CS納米顆粒更能增強pCD/Tp92疫苗的免疫保護效果;兩者聯(lián)合使用可達到較之其它疫苗組更好的免疫效果。
　　8.在各實驗組兔背部皮膚8個位點皮內(nèi)Tp感染后21d同比觀察比較,用CS+pCD/Tp92+pcD/IL-2聯(lián)合疫苗和pCD/Tp92+pcD/IL-2聯(lián)合疫苗免疫兔后感染位點皮損紅腫相對其它實驗組直徑最小,潰瘍形成率最少;PcD/Tp92和CS+pcD/Tp92疫苗組兔后感

8、染位點皮損皮損紅腫直徑同比中等大小;各對照組(CS+pcD,pcD,CS+PBS,PBS對照組)感染位點皮損紅腫直徑最大,潰瘍病灶形成數(shù)最多。
　　9.各疫苗組皮損變化情況相比較顯示CS+pCD/Tp92+pcD/IL-2聯(lián)合疫苗組的兔感染位點皮損紅腫初期最大(4.5mm),在頂峰期紅腫直徑最小(10mm),紅腫消退的時間也最短(42d);pCD/Tp92疫苗組皮損紅腫早期最小(2mm),但頂峰期紅腫直徑最大(12mm),紅腫消退

9、的時間也最長(>48d)。
　　結(jié)論:
　　1. CS+pcD/Tp92+pcD/IL-2聯(lián)合疫苗, pcD/Tp92+pcD/IL-2聯(lián)合疫苗, CS+pcD/Tp92疫苗及 pcD/Tp92疫苗組經(jīng)肌肉注射均可誘生較強的體液免疫和細胞免疫應答。
　　2.pcD/IL-2基因佐劑可以顯著加強pcD/Tp92疫苗長期穩(wěn)定的高抗體水平及高脾細胞增殖分化水平。
　　3.CS納米顆粒對pcD/Tp92疫苗的包裹的免疫效