心梗微環(huán)境適應(yīng)性殼聚糖基水凝膠的研制及其性能評價.pdf

1、在我國，心肌梗死的發(fā)病率和死亡率逐年攀升，并呈現(xiàn)年輕化的趨勢。目前臨床上主要以藥物治療和介入治療為主，雖然能在一定程度上緩解癥狀，改善患者的生存質(zhì)量，但是不能從根本上解決受損或梗死心肌的修復(fù)和重建，致使其死亡率居高不下。近年來發(fā)展細(xì)胞治療策略，雖然在一定程度上可以修復(fù)受損心肌，但是由于無法改善惡劣的心梗微環(huán)境（缺血、缺氧、凋亡、炎癥）致使其在心梗區(qū)的滯留率和存活率較低，長期效果不顯著。隨著材料科學(xué)、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和工程學(xué)的發(fā)展，以生物材

2、料、種子細(xì)胞和生長因子為基本要素的可注射性心肌組織工程策略有望克服細(xì)胞移植策略的缺點，以期實現(xiàn)真正意義上的心肌修復(fù)與重建，已成為心肌梗死治療研究的熱點。
　　在可注射心肌組織工程策略治療心肌梗死的研究中，生物材料起著非常關(guān)鍵的作用，可以作為種子細(xì)胞的載體提高其在心梗區(qū)域的滯留和存活，促進(jìn)受損心肌的修復(fù)與重建。但是，目前使用的可注射性生物材料，在設(shè)計時往往以提高材料的化學(xué)、物理以及加工性能為出發(fā)點而沒有充分考慮心梗后缺血、缺氧的微環(huán)

3、境。
　　一方面，心梗后的組織缺血、缺氧會導(dǎo)致局部環(huán)境中產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)，會造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞甚至細(xì)胞死亡，影響心梗后的損傷修復(fù)。因此，有必要設(shè)計具有良好抗氧化能力的可注射水凝膠來抑制ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。最近已有一些可注射性抗氧化水凝膠用來修復(fù)受損皮膚和髓核組織，但在心肌組織工程研究中還未有報道。另一方面，梗死心肌的再血管化對于心梗修復(fù)是非常重要的，會影響移植細(xì)胞和宿主細(xì)胞的存活、增殖和成熟。目前常通過材料攜帶

4、或直接注射血管形成相關(guān)的細(xì)胞和/或生長因子來促進(jìn)心梗區(qū)的血管新生。但是，直接注射細(xì)胞不利于細(xì)胞的滯留和存活，而且惡劣的微環(huán)境使生長因子的活性降低進(jìn)而影響其治療效果，同時昂貴的價格也限制生長因子的應(yīng)用。因此，研發(fā)出能在低氧微環(huán)境下促進(jìn)血管生成的可注射性生物材料具有十分重要的意義。
　　殼聚糖是具有良好生物相容性的天然氨基多糖，常被用作可注射性水凝膠材料。因其分子鏈上的活性基團(tuán)而具備一定的抗氧化能力和一定的促血管形成能力。但是，一方面

5、高分子量的殼聚糖由于分子間和分子內(nèi)較強的相互作用力使其抗氧化活性較弱，而相低分子量的殼聚糖又難以形成均一穩(wěn)定的凝膠;另一方面，殼聚糖雖然具有促血管生成活性，但是其在心梗微環(huán)境下的能力還顯不足。所以如何使高分子量殼聚糖擁有良好的抗氧化性能和在心梗微環(huán)境下的促血管形成能力是基于殼聚糖水凝膠的可注射性心肌組織工程面臨的主要難題。
　　眾所周知，谷胱甘肽(GSH)是一種重要的天然抗氧化劑。但分子量低，熱穩(wěn)定性差，因而生物效能受到影響。為此

6、，研究人員將GSH接枝到高聚物分子上來增強它的穩(wěn)定性和理化性能。RoY是一種可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的合成多肽，注射入動物缺血組織中呈現(xiàn)出良好的促血管形成能力。RoY通過與低氧條件下細(xì)胞表面的GRP78受體結(jié)合進(jìn)而激活相關(guān)信號通路來促進(jìn)血管生成。因此，將具有血管生成活性的RoY接枝到殼聚糖大分子上具有一定的應(yīng)用潛能，有望提高低氧環(huán)境中的血管生成活性，尚未見有相關(guān)報道。
　　針對以上分析，本研究從調(diào)控心梗微環(huán)境的目的出發(fā)，以期

7、研制出具有抗氧化、在心梗微環(huán)境下促血管生成的新型可注射性生物材料。為此，本研究主要從以下兩個方面開展相關(guān)工作:
　　第一部分殼聚糖-谷胱甘肽抗氧化水凝膠的研制及其性能評價
　　實驗一:氯化殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物的研制及其性能檢測。首先采用EDC化學(xué)法將GSH連接到高分子量的CSCl分子鏈上，合成不同取代度的CSCl-GSH復(fù)合物。分別通過氫譜核磁、紅外光譜、熱差分析跟蹤CSCl-GSH的形成。通過研究其清除不同類型ROS（超

8、氧自由基、羥自由基、有機氧自由基）的能力來評價其抗氧化性能，并分析復(fù)合物的取代度及濃度與抗氧化能力之間的內(nèi)在關(guān)系。
　　結(jié)果顯示，GSH以共價鍵的形式接枝到CSCl分子的氨基上，可以通過改變CSCl與GSH的投料比、EDC用量來調(diào)控CSCl-GSH復(fù)合物的取代度。此外，CSCl-GSH復(fù)合物具有良好的熱穩(wěn)定性，熱降解溫度隨取代度的增加而升高。同時復(fù)合物抗氧化性能良好，對各種ROS的清除能力均隨濃度的提高而提高;對于不同類型的ROS

9、，取代度對清除效果的影響有所不同，高取代度的復(fù)合物有利于對超氧自由基和DPPH有機氧自由基的清除，理論取代度為10％的復(fù)合物清除羥自由基的效果最佳。
　　實驗二:氯化殼聚糖-谷胱甘肽水凝膠的研制及其性能評價。在實驗一的基礎(chǔ)，以CSCl-GSH復(fù)合物為基材制備了溫敏性的水凝膠，分別評價了CSCl-GSH水凝膠的粘度、降解性能和毒性。然后以心肌細(xì)胞為對象，考察了心肌細(xì)胞在水凝膠表面的粘附性能、在水凝膠內(nèi)部的存活與形態(tài)，評價了CSCl-

10、GSH水凝膠的生物相容性。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CSCl-GSH復(fù)合物溶液中通過加入β-甘油磷酸鈉形成了溫敏性的可注射性水凝膠，室溫下為可流動的液態(tài)，當(dāng)溫度高于36℃時迅速形成凝膠，GSH的引入有利于增強水凝膠的溫敏特性。相比于CSCl水凝膠，CSCl-GSH水凝膠能夠支持心肌細(xì)胞的粘附和存活，具有良好的生物相容性。
　　實驗三:ROS環(huán)境下氯化殼聚糖-谷胱甘肽水凝膠調(diào)控心肌細(xì)胞生物學(xué)行為的研究。通過過氧化氫(H2O2)構(gòu)建體外

11、ROS微環(huán)境，觀察培養(yǎng)在CSCl-GSH水凝膠中的心肌細(xì)胞存活情況。然后從以下三方面綜合評價H2O2條件下CSCl-GSH水凝膠對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的調(diào)控作用。(1)通過DHE、DCFH-DA染色和NO含量測定，考察水凝膠對細(xì)胞內(nèi)超氧自由基、總ROS以及NO水平的影響。(2)通過檢測過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的酶活力來評價水凝膠中細(xì)胞的抗氧化能力。(3)通過檢測丙二醛含量，評價水凝膠對細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化水平的影響。此外，通過Western

12、 blotting實驗檢測caspase3活化水平，分析評價H2O2條件下水凝膠對心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果表明，在H2O2構(gòu)建的ROS條件下，生長在CSCl-GSH水凝膠中的心肌細(xì)胞存活狀態(tài)良好。與CSCl水凝膠相比，在高濃度H2O2微環(huán)境中CSCl-GSH水凝膠可以有效地清除心肌細(xì)胞內(nèi)各種自由基，取代度越高，清除效果越明顯。在減少了細(xì)胞內(nèi)ROS的基礎(chǔ)上，CSCl-GSH水凝膠可降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力。同時CSCl-GSH水

13、凝膠可降低細(xì)胞內(nèi)因ROS反應(yīng)生成的丙二醛含量，降低了脂質(zhì)氧化水平，減輕了氧化應(yīng)激損傷。此外，CSCl-GSH水凝膠通過減少caspase3的活化抑制了心肌細(xì)胞的凋亡。
　　第二部分:具有促血管形成功能的殼聚糖-RoY水凝膠研制及其性能評價
　　實驗一:氯化殼聚糖-RoY水凝膠的研制及表征。本實驗利用EDC化學(xué)法將RoY多肽與氯化殼聚糖大分子相結(jié)合，合成CSCl-RoY復(fù)合物。通過調(diào)整RoY與CSCl的投料比、EDC用量來調(diào)控

14、復(fù)合物中RoY的取代度。通過氫譜核磁、紅外光譜、熱差分析對CSCl-RoY復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。在此基礎(chǔ)上，制備了CSCl-RoY水凝膠，分析了水凝膠的體外降解行為。
　　結(jié)果顯示，RoY通過酰胺鍵的形式接枝到CSCl分子鏈上，通過改變CSCl與RoY的投料比合成了不同取代度的CSCl-RoY復(fù)合物，熱穩(wěn)定性良好。制備的CSCl-RoY水凝膠具有良好的溫敏性，且降解速率明顯低于CSCl水凝膠。
　　實驗二:氯化殼聚糖-R

15、oY水凝膠對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控及相關(guān)機制研究。本實驗以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為模型，系統(tǒng)研究在正常(21％O2)與低氧(3％O2)條件下CSCl-RoY水凝膠對HUVECs存活、增殖、遷移和成管腔能力的調(diào)控作用，并探索GRP78的表達(dá)、Akt和ERK1/2磷酸化水平，揭示CSCl-RoY水凝膠在低氧環(huán)境下影響HUVECs生物學(xué)行為的分子機制。
　　結(jié)果說明，相對于正常O2條件和CSCl水凝膠，低氧條件下CS

16、Cl-RoY水凝膠更有利于HUVECs存活、增殖、遷移和形成管腔結(jié)構(gòu)，且與RoY取代度有一定關(guān)系，低氧條件下，中、高取代度的CSCl-RoY水凝膠在提高細(xì)胞增殖活力和促管腔形成方面優(yōu)于低取代度水凝膠，在促進(jìn)細(xì)胞遷移方面，高取代度凝膠的優(yōu)勢最為明顯。進(jìn)一步的的實驗表明，在低氧環(huán)境中，相對于CSCl水凝膠，在CSCl-RoY水凝膠中HUVECs的胞膜GRP78相對下調(diào)，同時Akt和ERK1/2的磷酸化水平相對提高。說明CSCl-RoY水凝膠

17、可在低氧微環(huán)境下調(diào)節(jié)HUVECs胞膜表面的GRP78受體表達(dá)，激活與細(xì)胞存活、增殖相關(guān)的Akt和ERK1/2信號通路，從而促進(jìn)HUVECs的存活、增殖、遷移等生物學(xué)行為。
　　實驗三:氯化殼聚糖-RoY水凝膠對大鼠心梗區(qū)血管形成及心梗修復(fù)的影響。本實驗將PBS、CSCl和CSCl-RoY水凝膠注射入大鼠心梗區(qū)域，通過H&E、Masson三色染色以及血管特異性抗體免疫熒光染色，比較各組間的相對心梗面積、室壁厚度、微小血管密度與直徑，

18、研究CSCl-RoY水凝膠對心肌損傷、修復(fù)以及心梗區(qū)血管形成的影響。
　　結(jié)果表明，相對于PBS和CSCl水凝膠，CSCl-RoY水凝膠能夠明顯增加心梗區(qū)微小血管的密度，一定程度增加血管直徑，說明其具有較好的促血管生成能力。同時注射CSCl-RoY水凝膠使心梗區(qū)保留了更多的心肌纖維，存在有更多血管組織。CSCl-RoY水凝膠能明顯減少心梗面積、一定程度增加室壁厚度。
　　綜上所述，本研究將GSH共價連接到高分子量的CSCl上

19、，合成抗氧化能力可調(diào)的CSCl-GSH復(fù)合物，克服了高分子量殼聚糖抗氧化能力弱的缺點。在此基礎(chǔ)上制備了具有優(yōu)良溫敏性能CSCl-GSH水凝膠，該水凝膠不僅能支持心肌細(xì)胞的粘附，而且在ROS微環(huán)境下，可有效消除心肌細(xì)胞內(nèi)ROS，減少細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷與凋亡。另一方面，將擁有低氧條件下血管生成活性的RoY接枝到CSCl大分子鏈上，并制備溫敏性的CSCl-RoY水凝膠。其可以影響HUVECs表面的GRP78受體表達(dá)，激活與存活、增殖相關(guān)的Ak