急性炎癥對(duì)黑色素瘤生長和血管生成的影響及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1863年Virchow提出，腫瘤的形成源自慢性炎癥，從此展開了對(duì)腫瘤與炎癥之間關(guān)系的研究。本研究利用黑色素瘤這一常見的惡性腫瘤為模型，建立了同時(shí)存在手術(shù)切口的荷瘤小鼠，通過觀察急性炎癥對(duì)腫瘤體積、微血管密度（Microvessel density，MVD）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）-a、基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）

2、家族中的MMP-2和MMP-9的表達(dá)及其活性，及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)觀察轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor，TGF）-β和干擾素（Interferon，IFN）-γ對(duì)B16F10細(xì)胞的影響，來評(píng)價(jià)當(dāng)機(jī)體同時(shí)存在急性炎癥（手術(shù)傷口）和腫瘤時(shí)，急性炎癥對(duì)黑色素瘤的影響，并對(duì)其相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。主要研究內(nèi)容如下： 第一部分：小鼠黑色素瘤急性炎癥模型的建立 本研究選擇了黑色素瘤，這一高度惡性且早

3、期血行轉(zhuǎn)移的腫瘤作為研究模型，依靠C57BL小鼠和B16F10黑色素瘤細(xì)胞來構(gòu)建急性炎癥，腫瘤的動(dòng)物模型，待黑色素瘤長至500 mm3左右時(shí)，建立不同類型的急性炎癥-黑色素瘤模型：A組為單純創(chuàng)傷-黑色素瘤模型，B組為重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)-黑色素瘤模型，C組為創(chuàng)傷/化膿菌-黑色素瘤模型，D組為創(chuàng)傷/冰乙酸-黑色素瘤模型，E組為單純腫瘤模型（對(duì)照組）。每日觀察腫瘤生長及傷口愈合情況、繪制腫瘤生長曲線，比較不同急性炎癥-腫瘤模型的效果。 三種建模

4、的方式均可達(dá)到持續(xù)炎癥刺激的效果，但創(chuàng)面和其他情況各不相同：B組小鼠創(chuàng)面干凈，結(jié)痂和滲出均不明顯，組織成分新老交替，但需每日麻醉小鼠后擴(kuò)創(chuàng)，操作復(fù)雜；C組小鼠創(chuàng)面有膿痂覆蓋，建模操作簡便，但小鼠有罹患敗血癥的危險(xiǎn)，且由于金葡菌感染力強(qiáng)，要求單獨(dú)飼養(yǎng)；D組小鼠的創(chuàng)面較C組干凈，創(chuàng)口處組織成分較B組均一，但冰乙酸具有腐蝕能力，建模過程中易損傷大中型血管及其他敏感部位。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)模型可以盡量避免外源因素的干擾，并且結(jié)果穩(wěn)定可靠

5、，本研究選用重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)-黑色素瘤模型作為下一步實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型。 第二部分：急性炎癥對(duì)黑色素瘤體積及血管生成的影響 腫瘤血管生成是腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞與其微環(huán)境相互影響的復(fù)雜的過程，多種活性物質(zhì)可調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成。炎癥過程中產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子也可調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移、塑形和凋亡，從而在血管生成過程發(fā)揮重要作用。根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)-黑色素瘤模型為本研究的急性炎癥荷瘤鼠模型。HE染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照

6、組腫瘤MVD，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組織VEGF表達(dá)，探討急性炎癥對(duì)黑色素瘤組織血管生成的影響。 實(shí)驗(yàn)將小鼠分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組。建模后隔日分別測(cè)量對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，內(nèi)眥取血。建立急性炎癥模型后第7和11天處死動(dòng)物，分離腫瘤組織，福爾馬林固定并制備蠟塊。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1．急性炎癥對(duì)腫瘤的生長呈現(xiàn)了先抑制后失抑制的表象，即在造模后第7天之內(nèi)表現(xiàn)為急性炎癥抑制腫瘤的生長（早期抑制時(shí)相），而第7天之

7、后，這種抑制作用減弱，至第11天，實(shí)驗(yàn)組的腫瘤體積恢復(fù)到與對(duì)照組相同水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05，晚期失抑制時(shí)相）。2．抑制時(shí)相期腫瘤組織的MVD計(jì)數(shù)對(duì)照組高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。3．抑制時(shí)相期腫瘤免疫組織化學(xué)染色VEGF陽性表達(dá)率，對(duì)照組顯著高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。 本研究所建立的模型是通過模擬急性炎癥的病理生理過程來觀察其直接和間接對(duì)腫瘤組織的影響作用，特別關(guān)注急性炎癥或傷

8、口修復(fù)過程中的“調(diào)控性”因素對(duì)腫瘤組織生長和血管生成的影響。這種影響作用主要體現(xiàn)為先抑制后失抑制的過程，其抑制作用不但與炎癥因子的直接刺激有關(guān)，也可能與某些炎癥灶釋放入血的抑制因子有關(guān)，失抑制則可能與炎癥晚期分泌某種因子的拮抗作用有關(guān)。 第三部分：急性炎癥對(duì)黑色素瘤基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)及活性的影響 研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織決不是癌細(xì)胞簡單相加的總和，腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞有著密切的協(xié)作，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、炎性免疫細(xì)胞比如巨噬細(xì)

9、胞、平滑肌細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞，這些細(xì)胞通過細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）相互聯(lián)結(jié)共同構(gòu)成腫瘤間質(zhì)成分。腫瘤間質(zhì)成分對(duì)腫瘤細(xì)胞本身的生長和遷移都產(chǎn)生重要的影響?；|(zhì)金屬蛋白酶家族在腫瘤及其微環(huán)境中參與降解和重塑ECM，對(duì)腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移具有重要的作用，同時(shí)也與急性炎癥創(chuàng)傷愈合肉芽組織形成密切相關(guān)。MMP-2與MMP-9是MMPs的重要成員，在腫瘤微循環(huán)和創(chuàng)傷愈合過程中具有重要作用。 本部分研

10、究利用免疫組織化學(xué)染色觀察腫瘤組織MMP-2和MMP-9的表達(dá)情況，利用明膠酶譜法定量分析腫瘤組織MMP-2和MMP-9的活性來評(píng)價(jià)當(dāng)機(jī)體同時(shí)存在急性炎癥和腫瘤時(shí)，急性炎癥對(duì)腫瘤的MMPs表達(dá)與活性的影響。 由此可見，急性炎癥可能通過某種途徑影響了腫瘤細(xì)胞的MMP-2和MMP-9的表達(dá)量和活性，這種影響作用也呈現(xiàn)為早期時(shí)相的抑制和晚期時(shí)相的失抑制，與本研究第二部分對(duì)于腫瘤體積的觀察結(jié)果相吻合，但為何晚期出現(xiàn)失抑制現(xiàn)象有待于進(jìn)一步

11、研究。 第四部分：IFN-γ和TGF-β對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲作用影響的研究 急性炎癥的過程涉及到早期的炎癥因子釋放和晚期的肉芽組織修復(fù)兩個(gè)階段，而本實(shí)驗(yàn)所制造的傷口模型由于重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)，充當(dāng)了早期炎癥因子釋放這個(gè)階段。該階段涉及了多種炎癥因子和炎細(xì)胞浸潤，炎癥組織局部表現(xiàn)為炎細(xì)胞浸潤，炎細(xì)胞浸潤主要為粒細(xì)胞系統(tǒng)，而影響腫瘤的則可能是炎癥灶釋放的炎癥因子通過血液循環(huán)間接干擾腫瘤本身。 為了進(jìn)一步證實(shí)炎癥局部釋

12、放的炎癥因子對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響．本研究通過第二部分研究所獲得的血清對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行了分析和篩選，發(fā)現(xiàn)IFN-γ和TGF-β具有一定的動(dòng)態(tài)變化意義，進(jìn)而選擇C57BL小鼠來源B16F10細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過施加細(xì)胞因子IFN-γ和TGF-β，觀察兩者對(duì)B16F10細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，自小鼠尾靜脈注入IFN-γ，觀察其對(duì)腫瘤生長的影響。 磺酰羅丹明（Sulforhodamine B，SRB）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

13、明：TGF-β干預(yù)組腫瘤細(xì)胞存活率高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）； IFN-γ干預(yù)組腫瘤細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）；同時(shí)給予IFN-γ和TGF-β干預(yù)時(shí)，腫瘤細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。給予不同細(xì)胞因子處理時(shí)，隨細(xì)胞存活率的變化，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為不同的形態(tài)，說明IFN-γ可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而TGF-β則可拮抗IFN-γ的這種作用，使腫瘤細(xì)胞

14、重獲并增強(qiáng)其增殖、遷移和侵襲的能力。自小鼠尾靜脈注入IFN-γ（注射組），生長曲線表現(xiàn)為早期抑制時(shí)相和晚期失抑制時(shí)相。明膠酶譜分析表明IFN-γ降低黑色素瘤MMPs活性，TGF-β升高M(jìn)MPs活性，二者存在拮抗作用。 該實(shí)驗(yàn)揭示了腫瘤細(xì)胞分泌TGF-β對(duì)抗IFN-γ這一生物學(xué)現(xiàn)象，解釋了急性炎癥對(duì)腫瘤影響作用呈現(xiàn)為早期抑制和晚期失抑制的可能機(jī)制，提出IFN-γ/TGF-β的動(dòng)態(tài)變化可能在急性炎癥對(duì)腫瘤生長影響的過程中發(fā)揮重要作用

15、。 綜上所述，本研究通過建立急性炎癥荷瘤鼠動(dòng)物模型，應(yīng)用免疫組化染色、明膠酶譜分析及體外細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)，觀察急性炎癥對(duì)腫瘤體積、MVD、VEGF-a表達(dá)、MMP-2和MMP-9表達(dá)及活性的影響，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察TGF-β和IFN-γ的動(dòng)態(tài)變化對(duì)腫瘤的影響。主要結(jié)論如下： 1．建立單純創(chuàng)傷、創(chuàng)傷+化膿菌、創(chuàng)傷+冰乙酸和重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)與荷瘤鼠四種急性炎癥-腫瘤復(fù)合動(dòng)物模型。結(jié)果表明：單純創(chuàng)傷-黑色素瘤模型對(duì)腫瘤生長無影響，后三

16、者均可抑制腫瘤生長、且對(duì)腫瘤生長抑制程度相同，說明急性炎癥未達(dá)到一定的強(qiáng)度和時(shí)間對(duì)腫瘤生長無影響，當(dāng)達(dá)到一定的強(qiáng)度并持續(xù)一定時(shí)間時(shí)，可以抑制腫瘤的生長。 2．三種有效抑制腫瘤生長的動(dòng)物模型各有所長，應(yīng)結(jié)合實(shí)際條件，遵循科學(xué)合理、方便可行的原則進(jìn)行選擇。本研究選擇重復(fù)擴(kuò)創(chuàng)．黑色素瘤模型作為本研究動(dòng)物模型。 3．急性炎癥時(shí)實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積小于對(duì)照組，腫瘤組織中VEGF-a表達(dá)減少，MVD降低，說明急性炎癥對(duì)腫瘤組織的影響主要體

17、現(xiàn)為抑制，包括抑制腫瘤生長和抑制血管生成。 4．通過對(duì)腫瘤組織的免疫組織化學(xué)染色觀察和明膠酶譜分析表明，急性炎癥抑制腫瘤組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)與活性，從而抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長。 5．觀察細(xì)胞因子IFN-γ、TGF-β對(duì)炎癥-腫瘤模型的動(dòng)態(tài)影響和對(duì)體外培養(yǎng)B16F10細(xì)胞影響的結(jié)果表明：IFN-γ可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而TGF-β則可對(duì)抗IFN-γ的作用，使腫瘤細(xì)胞重獲生長和侵襲能力，增強(qiáng)