乙酰羥酸合成酶分子體外篩選模型的構(gòu)建及其與除草劑的相互作用.pdf

1、乙酰羥酸合成酶(AHAS)是一個(gè)廣泛存在于植物和微生物體內(nèi)誘導(dǎo)支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸合成的關(guān)鍵性酶。已經(jīng)證實(shí)它為多種除草劑靶酶，如目前廣泛使用的除草劑磺酰脲類和咪唑啉酮類。本研究從植物擬南芥葉片中克隆了乙酰羥酸合成酶催化亞基基因，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了乙酰羥酸合成酶催化亞基，并研究了表達(dá)產(chǎn)物的活性被除草劑的抑制作用，并用熒光法研究乙酰羥酸合成酶與氯嘧磺隆、咪草煙和單嘧磺隆中間體的相互作用。主要研究結(jié)果如下

2、： (1)從擬南芥葉片中提取總RNA，根據(jù)已報(bào)道的擬南芥AHAS序列(NM114714)，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增，獲得了包含乙酰羥酸合成酶催化亞基基因的DNA片段(GenBank接受號(hào)：DQ991161)，此片段包含一個(gè)2013bp的讀碼框(編碼670個(gè)氨基酸)，與參考序列(NM114714)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)本研究所克隆的乙酰羥酸合成酶催化亞基基因序列與NM114714的氨基酸序列同源性高達(dá)99％。 (2)利用SalI和No

3、tI位點(diǎn)，將本研究所克隆的擬南芥乙酰羥酸合成酶催化亞基基因(去除前85個(gè)氨基酸的導(dǎo)肽序列)克隆入大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，以融合形式進(jìn)行蛋白表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析表明，在69KDa附近獲得了預(yù)期的表達(dá)條帶，且表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中以包涵體形式存在。 (3)利用NotI位點(diǎn)將本研究所克隆的擬南芥乙酰羥酸合成酶催化亞基基因克隆入酵母表達(dá)載體pPIC9K，將經(jīng)過(guò)PCR和酶切同時(shí)鑒定獲得

4、的正向連接重組子轉(zhuǎn)化入酵母菌株GS115，篩選(Mut+)重組子并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了預(yù)期的AHAS表達(dá)條帶(72kDa左右)，表達(dá)產(chǎn)物以分泌形式表達(dá)。產(chǎn)物表達(dá)時(shí)相分析表明，在誘導(dǎo)72小時(shí)后表達(dá)量最高。 (4)將利用大腸桿菌表達(dá)的擬南芥乙酰羥酸合成酶催化亞基包涵體在變性條件下用鎳柱純化，再經(jīng)稀釋法復(fù)性，進(jìn)行活性測(cè)定，測(cè)得酶活值為1.18×10-8μmol/min，酶比活值為1.31μmol/mg·min。將利用畢赤酵母表達(dá)的擬

5、南芥乙酰羥酸合成酶催化亞基進(jìn)行粗酶活性測(cè)定，表明酶活值為1.11×10-8μmol/min，比活性為0.59μmol/mg·min。 (5)利用熒光光譜法研究了溶液狀態(tài)下乙酰羥酸合成酶與除草劑氯嘧磺隆(簡(jiǎn)稱CE)、咪草煙(IQ)和農(nóng)藥單嘧磺隆中間體的相互作用。確定了乙酰羥酸合成酶的熒光峰，結(jié)果表明CE和IQ對(duì)AHAS靜態(tài)熒光猝滅，推測(cè)CE、IQ與AHAS之間能夠形成復(fù)合物，主要為疏水作用，37℃下的猝滅常數(shù)Kq分別為4.73×1