FOXO1在霍奇金淋巴瘤中是一種抑癌基因.pdf

1、cHL淋巴瘤是一種特殊的腫瘤，其惡性腫瘤細胞--霍奇金鏡像細胞（HRS細胞）僅占腫瘤團塊的大約1％，腫瘤組織中細胞成分中絕大多數(shù)為間質(zhì)細胞和浸潤細胞。cHL 淋巴瘤屬于生發(fā)中心或者后生發(fā)中心B細胞來源的B細胞淋巴瘤，具有克隆性免疫球蛋白基因重組。與其他大多數(shù)B細胞淋巴瘤不同的是，HRS細胞的免疫表型不同于任何造血細胞，幾乎不表達B細胞標志。其可能的機制有多種，例如B細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的缺乏、轉(zhuǎn)錄抑制因子的過表達，及表觀遺傳學(xué)機制，都被認

2、為對B細胞特異性基因在HRS細胞中的表達有抑制作用。HRS細胞的另一個突出特點是，多種信號通路包括核因子κB（NF-κB）、Jak-Stat、PI3K-AKT/PKB、ERK、AP1和receptor tyrosine kinases (RTK)通路，以及EB 病毒相關(guān)蛋白等的異?；罨S持了HRS細胞的存活和增值。而AKT/PKB 通路和ERK 通路的一個重要下游靶因子是FOXO 轉(zhuǎn)錄因子家族。Forkhead 蛋白以擁有高保守DNA結(jié)

3、合區(qū)域the forkhead box 為特征。FOXO是forkhead 轉(zhuǎn)錄因子家族中被研究得最多的亞族之一。FOXO 家族由四位成員組成，分別是FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6。翻譯后共價修飾機制在FOXO 活性的調(diào)控中起到主要的作用。蛋白激酶包括AKT/PKB、IkB kinase（IKK）、SGK以及ERK，可磷酸化FOXO 蛋白，引起FOXO的核外轉(zhuǎn)移和降解，從而抑制其活性。通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因，F(xiàn)OXO 發(fā)揮抑

4、制生長，誘導(dǎo)分化或者凋亡及對抗過氧化損傷等作用。已知的FOXO 靶基因包括細胞周期調(diào)控基因CCND2、CDKN1A和CDKN1B，前凋亡基因BIM，NOXA和FASL。成熟B細胞的存活依賴正常的BCR 信號通路，后者激活NF-κB，PI3KAKT/PKB等通路，促進B細胞存活、增殖。缺乏正常BCR的B細胞不可避免的發(fā)生凋亡。近期研究表明，激活PI3K 通路或敲除FOXO1 可挽救缺失BCR 信號的B細胞的凋亡。
　　 目的：FO

5、XO 家族在多種類型腫瘤中發(fā)揮著重要的抑癌作用。研究表明FOXO1表達的下調(diào)與B細胞發(fā)育和存活有關(guān)，敲除FOXO1 可使缺失BCR 信號的B細胞免于凋亡并持續(xù)增殖。cHL的HRS細胞沒有正常的BCR 信號，卻能免于凋亡、并持續(xù)增殖。因此，我們假設(shè)：在成熟B細胞向cHL 惡性轉(zhuǎn)化中，F(xiàn)OXO1是否也扮演著抑癌基因的角色？
　　 方法：首先用Genesifter 軟件分析了網(wǎng)絡(luò)已發(fā)表的基因芯片數(shù)據(jù)，并以實時定量PCR（qPCR），W

6、estern immunoblot和免疫組化的方式驗證，以期闡明FOXO1在正常B細胞及淋巴瘤中的表達水平。在低表達FOXO1的cHL細胞株中，穩(wěn)定導(dǎo)入可誘導(dǎo)表達的FOXO1基因；Western immunoblot 驗證導(dǎo)入基因的表達；利用FACS等方法檢測FOXO1表達對淋巴瘤細胞株增殖、存活的影響；并進一步通過qPCR驗證了FOXO1 靶基因?qū)OXO1基因功能的貢獻。最后，我們用熒光原位雜交（FISH）和比較基因組雜交分析（ar

7、ray-CGH）檢測FOXO1基因組位點在cHL中是否有拷貝數(shù)缺失等突變。
　　 結(jié)果：利用Genesifter 軟件，我們比較了數(shù)據(jù)庫中FOXO1、FOXO3和FOXO4在HRS細胞及正常B 淋巴細胞亞群中的表達水平。在大多數(shù)B細胞亞型中，F(xiàn)OXO1的表達水平高于FOXO3和FOXO4，在生發(fā)中心B細胞—中心母細胞和中心細胞（CB+CC）中尤為顯著。cHL 淋巴瘤樣本中，F(xiàn)OXO1的表達水平顯著低于正常B細胞亞群，而FOXO3

8、和FOXO4的表達水平在正常B細胞與HRS細胞中并沒有顯著的差異。為了驗證基因芯片分析所得的結(jié)果，我們用定量PCR的方法檢測了FOXO1和FOXO3在CD19+B細胞，cHL細胞株和Burkitt′s 淋巴瘤（BL）細胞株及其他B細胞淋巴瘤細胞株中的表達。其結(jié)果與基因芯片分析結(jié)果相一致。FOXO1在CD19+B細胞中的相對表達水平遠遠高于FOXO3。FOXO1在正常B細胞中的表達水平顯著高于其在cHL細胞株中的表達水平。FOXO1的mR

9、NA 水平在cHL細胞株中最低，在BL細胞株中也降低，但比cHL細胞株表達水平高。Westernimmunoblot 結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO1的蛋白表達水平在正常CD19+B細胞遠高于cHL細胞株。為了排除FOXO1在cHL細胞株中的低表達水平是由于細胞株體外培養(yǎng)而造成的偏差，我們用FOXO1 抗體染色增生的扁桃體標本和cHL 標本。在扁桃體含有高密度中心母細胞的生發(fā)中心暗區(qū)(DZ)表現(xiàn)出強染色，同樣，幼稚B細胞和記憶B細胞所在的濾泡套區(qū)f

10、ollicular mantle zone (MZ)也呈現(xiàn)出強染色。稍弱的染色在以中心細胞為主的生發(fā)中心亮區(qū)可見。在T細胞區(qū)可見少許FOXO1 陽性細胞。在32例cHL 淋巴瘤樣本中，31例的霍奇金鏡像細胞的FOXO1表達為陰性，只有1例的霍奇金鏡像細胞FOXO1 呈現(xiàn)微弱的表達。相比之下，在HRS細胞周圍的反應(yīng)性細胞中，F(xiàn)OXO1 呈強陽性表達。在20例臨床結(jié)節(jié)性淋巴細胞為主型霍奇金淋巴瘤（NLPHL）腫瘤標本中，14例腫瘤細胞L&H

11、細胞FOXO1 染色呈陰性。為探討FOXO1的下調(diào)在cHL 腫瘤發(fā)生中的潛在作用，我們使用了一個可誘導(dǎo)的FOXO1(A3)ER 體系，A3 代表FOXO1基因的絲氨酸和蘇氨酸位點分別被三個丙胺酸取代，導(dǎo)致FOXO1 蛋白不會被AKT/PKB和SGK 磷酸化，保證了FOXO1 蛋白的活性。而且，F(xiàn)OXO1 編碼區(qū)與突變的雌激素受體（ER）相融合，形成特殊的他莫昔芬可激活體系。經(jīng)Western immunoblot 驗證，穩(wěn)定感染所得的L4

12、28、KMH2、L1236、UHO1和SUP-HD1 都成功表達FOXO1(A3)ER。然后，我們研究了FOXO1 激活后對cHL細胞株L428、KMH2、L1236、UHO1和SUP-HD1細胞生長的影響。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1 激活后導(dǎo)致所有cHL細胞株活細胞數(shù)量顯著減少。FOXO 轉(zhuǎn)錄因子可以通過激活或者抑制靶基因的表達而抑制生長、誘導(dǎo)凋亡。因此，我們驗證了靶基因?qū)OXO1基因功能的貢獻。CCND2 (cyclin D2)是細胞周

13、期G1/S 轉(zhuǎn)變所需的基因，在cHL中通常呈現(xiàn)高表達。FOXO1的激活顯著抑制了CCND2在cHL細胞株的表達。另外，細胞周期抑制基因CDKN1B (p27，Kip1)則在FOXO1 激活后被上調(diào)。FOXO1基因位于13q14。在探討FOXO1表達下調(diào)機制過程中，我們在53例臨床cHL 標本中發(fā)現(xiàn)6例有13q14 染色體缺失(11.3％)，在5種cHL細胞株中，有4種細胞株有不同程度的13q 染色體缺失。此外，我們發(fā)現(xiàn)針對AKT/PKB

14、或者MEK1/2的抑制劑可部分恢復(fù)FOXO1在cHL細胞系的表達，而且這些抑制劑對FOXO1表達的促進作用與其對細胞生長的抑制作用相關(guān)。
　　 結(jié)論：FOXO1在正常B細胞尤其是生發(fā)中心B細胞中高表達，在cHL的腫瘤成分HRS細胞中表達明顯下調(diào)。FOXO1的低轉(zhuǎn)錄水平與染色體缺失有關(guān)。而AKT/PKB和MEK的持續(xù)活性引起FOXO1 蛋白降解。在低表達FOXO1的cHL細胞系中，導(dǎo)入FOXO1基因可抑制腫瘤細胞生長，并引起凋亡。