JNK介導的轉(zhuǎn)化生長因子-β-,1-對神經(jīng)干細胞缺氧損傷保護作用的研究.pdf

1、目的:觀察在神經(jīng)干細胞缺氧損傷過程中，JNK是否被激活以及是否參與介導了缺氧所引起的神經(jīng)干細胞的凋亡。研究TGF-β<,1>(transforming growth factor-β<,1>，TGF-β<,1>)對缺氧所引起的神經(jīng)干細胞凋亡的保護機制是否與降低JNK的磷酸化水平有關(guān)。 方法: 1．從新生一天大鼠大腦皮質(zhì)分離培養(yǎng)、增殖傳代、誘導分化與鑒定神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)，所用培養(yǎng)液

2、為無血清DMEM／F12和B27，內(nèi)含h-bFGF(20ng／ml)和h-EGF(20ng／ml)，以胎牛血清誘導分化，用Nestin、β-ⅢTubulin和GFAP免疫細胞化學反應(yīng)鑒定細胞性質(zhì)和類型。 2．取傳代細胞，隨機分為6組：①正常組：普通培養(yǎng)7小時；②SP600125組：加XJNK抑制劑SP600125后普通培養(yǎng)7小時；③TGF-β<,1>組：加入TGF-β<,1>后普通培養(yǎng)7小時；④缺氧組：普通培養(yǎng)1小時后缺氧培養(yǎng)6

3、小時，條件為N<,2>94％、CO<,2> 5％、O<,2> 1％；⑤SP600125+缺氧組：加入JNK抑制劑SP600125后普通培養(yǎng)1小時，再缺氧培養(yǎng)6小時；⑥TGF-β<,1>+缺氧組：加入TGF-β<,1>后普通培養(yǎng)1小時，再缺氧培養(yǎng)6小時。各組在相應(yīng)時間點均用Hoechst33258進行熒光染色，鏡下觀察、計算Hoechst陽性細胞率，以比較SP600125和TGF-β<,1>對神經(jīng)干細胞缺氧損傷的影響。 3．取傳代

4、細胞，隨機分為3組：①正常組：普通培養(yǎng)5小時；②缺氧組：普通培養(yǎng)1小時后缺氧培養(yǎng)4小時，條件為N<,2> 94％、CO<,2> 5％、O<,2> 1％；③TGF-β<,1>+缺氧組：加入TGF-β<,1>后普通培養(yǎng)1小時，再缺氧培養(yǎng)4小時。各組在相應(yīng)時間點用Western blot方法檢測JNK磷酸化水平，以觀察神經(jīng)干細胞缺氧損傷過程中JNK的激活情況及TGF-β<,1>的保護作用。 結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以

5、均數(shù)±標準差表示(mean±SD)，Western blot數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，多個實驗組與一個對照組比較采用最小顯著差法(LSD)，實驗組之間比較采用q檢驗。凋亡率數(shù)據(jù)先用arcsin<根號P>轉(zhuǎn)換后進行方差齊性檢驗，然后行單因素方差分析。以P<0.05表示在統(tǒng)計學上有顯著性差異，P<0.01表示在統(tǒng)計學上有極顯著差異。 結(jié)果: 1.培養(yǎng)的細胞在未誘導分化前Nestin免疫反應(yīng)陽性，誘導分化后可分別呈B-IIITu

6、bulin、GFAP免疫反應(yīng)陽性，表明分離到的是神經(jīng)干細胞。 2.正常組、TGF-β<,1>組和SP600125組偶見Hoechst染色陽性細胞。缺氧組Hoechst染色陽性細胞，即凋亡細胞顯著增多(P<0.01)。TGF-β<,1>+缺氧組、SP600125+缺氧組的Hoechst陽性細胞比缺氧組明顯減少(P<0.01)，但仍比正常對照組、TGF-β<,1>組和SP600125組多(P<0.01)。 3.缺氧組磷酸化J

7、NK的表達比正常組顯著增高(Fig5)，其免疫印跡反應(yīng)條帶光密度值是正常組的2.27倍(P<0.01)。TGF-β<,1>+缺氧組的磷酸化JNK的表達比缺氧組顯著下降，僅為其0.60倍(P<0.01)，但仍比正常組高，是正常組的1.37倍(P<0.01)。 結(jié)論: 1.缺氧誘導神經(jīng)干細胞損傷過程中，JNK磷酸化水平顯著增加，使用JNK抑制劑后神經(jīng)干細胞的凋亡率顯著下降，提示JNK可能參與介導了缺氧所引起的神經(jīng)干細胞凋亡。