穿心蓮內(nèi)酯誘導(dǎo)髓系白血病細(xì)胞株U937和HL60細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究及機(jī)制初探.pdf

1、目的：惡性腫瘤是危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一。全世界每年約有700萬(wàn)人死于腫瘤，我國(guó)的腫瘤死亡人數(shù)也在百萬(wàn)以上。白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，約占癌腫總發(fā)病率的5％左右。白血病的治療以化療為主，其作用是全身性的，毒副作用大。雖然有骨髓移植、免疫治療、基因治療等治療手段，但目前藥物性化療仍然是治療白血病最重要和最基本的方法。化療最大的缺點(diǎn)是，化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也殺傷正常的組織和細(xì)胞，引起嚴(yán)重致死性的并發(fā)癥。因此需要尋找新的更有針對(duì)

2、性、低毒高效的治療藥物?，F(xiàn)有觀點(diǎn)認(rèn)為中西醫(yī)結(jié)合治療白血病的療效優(yōu)于單純化療。中草藥可減輕化療藥的毒副作用，提高機(jī)體免疫力，并可用于難治性急性白血病（AL）的挽救性治療。
　　 細(xì)胞凋亡（apoptosis）是數(shù)十年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域引起廣泛興趣和關(guān)注的研究熱點(diǎn)。許多天然中草藥可以通過(guò)干擾腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、增殖等過(guò)程，最終誘導(dǎo)觸發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。越來(lái)越多的資料表明無(wú)論是在殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、促進(jìn)凋亡

3、，調(diào)整機(jī)體免疫功能，改善癥狀與體征，還是減輕放化療毒副作用或?qū)δ[瘤患者的調(diào)理，中草藥都發(fā)揮著重要作用。近半個(gè)世紀(jì)來(lái)人們?cè)絹?lái)越關(guān)注從傳統(tǒng)中草藥中提取有效成分用于臨床抗腫瘤治療。
　　 穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide，Andro）是從穿心蓮中提取純化得到的二萜內(nèi)酯類單體化合物，在抗病毒、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等方面均有活性。穿心蓮內(nèi)酯的抗腫瘤作用機(jī)制主要表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞增殖、阻滯腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、

4、提高淋巴細(xì)胞抗腫瘤活性等方面。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要觀察穿心蓮內(nèi)酯對(duì)白血病細(xì)胞株U937和HL60的體外增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，并對(duì)其抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為穿心蓮內(nèi)酯作為抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.采用Cell Counting Kit-8試劑盒（CCK-8）檢測(cè)不同濃度穿心蓮內(nèi)酯處理白血病細(xì)胞株U937和HL60細(xì)胞48小時(shí)后對(duì)U937和HL60細(xì)胞的增殖抑制作用，并求出IC50的

5、值。
　　 2.對(duì)穿心蓮內(nèi)酯處理過(guò)的白血病細(xì)胞株U937和HL60細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞，采用常規(guī)Giemsa染色和Hoechst33342熒光染色，光鏡下觀察穿心蓮內(nèi)酯作用于細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。
　　 3.采用流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）分別檢測(cè)不同濃度穿心蓮內(nèi)酯（20、40、80μmol/L）作用于U937細(xì)胞和HL60細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞凋亡變化和細(xì)胞周期分布的改變。
　　 4

6、.采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription PCR，RT-PCR）半定量檢測(cè)不同濃度穿心蓮內(nèi)酯（20、40、80μmol/L）作用48小時(shí)后，U937和HL60細(xì)胞內(nèi)bcl-2、NF-κBmRNA的表達(dá)變化。
　　 5.應(yīng)用Caspase-Glo檢測(cè)試劑盒及比色法檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯作用48小時(shí)時(shí)，誘導(dǎo)U937和HL60細(xì)胞凋亡過(guò)程中caspase-3/7活力的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1

7、.穿心蓮內(nèi)酯在1～100μmol/L濃度范圍內(nèi)能明顯抑制白血病細(xì)胞U937細(xì)胞和HL60細(xì)胞體外增殖，抑制率呈明顯的濃度依賴性，與對(duì)照組比較各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中100μmol/L穿心蓮內(nèi)酯作用48小時(shí)后對(duì)U937細(xì)胞的抑制率最高，達(dá)到83.97％，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)HL60細(xì)胞增殖抑制作用不及U937細(xì)胞明顯，但作用48小時(shí)最高抑制率亦能達(dá)到71.64％。不同濃度穿心蓮內(nèi)酯（1、10、100μmol/L）作用48小時(shí)U

8、937細(xì)胞和HL60細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為：21.86μmol/l，46.41μmol/l。在此實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上確定穿心蓮內(nèi)酯的工作終濃度分別為20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L，在此濃度范圍內(nèi)也存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，抑制率分別隨著藥物濃度增加而增加，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 2.穿心蓮內(nèi)酯作用后，U937和HL60細(xì)胞均出現(xiàn)典型的凋亡特征。普通光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)

9、胞體積縮小、染色質(zhì)聚集、核固縮、核碎裂等；熒光顯微鏡下表現(xiàn)為凋亡細(xì)胞顯示熒光標(biāo)記，胞核濃集而呈亮藍(lán)色或核呈分葉，碎片狀，邊集。
　　 3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，穿心蓮內(nèi)酯可誘導(dǎo)急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯（由51.30％上升至94.10％），G2/M、S期細(xì)胞明顯減少；誘導(dǎo)急性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL60細(xì)胞發(fā)生S期阻滯（由39.48％上升至67.93％），G0/G1、G2/M期細(xì)胞減少。同時(shí)兩

10、種白血病細(xì)胞株產(chǎn)生明顯的細(xì)胞凋亡.以80μmol/L穿心蓮內(nèi)酯作用48h凋亡率最高，U937細(xì)胞達(dá)到52.48％，HL60細(xì)胞則為17.75％，凋亡不及U937細(xì)胞明顯。
　　 4.半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度穿心蓮內(nèi)酯（20、40、80μmol/L）處理48h后，U937細(xì)胞中bcl-2 mRNA表達(dá)水平隨藥物作用濃度的增加而降低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），NF-κB mRNA的表達(dá)水平亦隨藥

11、物作用濃度的增加而降低，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 5.用Caspase-Glo檢測(cè)試劑盒對(duì)caspase-3/7的活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，穿心蓮內(nèi)酯處理組Caspase-3/7酶活性增加，與未加藥的對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 結(jié)論：穿心蓮內(nèi)酯在一定濃度范圍內(nèi)，能抑制白血病U937和HL60細(xì)胞增殖，具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系；其對(duì)U937細(xì)胞和HL60細(xì)胞的抑制作用可能與