車前子多糖對氧化型低密度脂蛋白誘導的大鼠主動脈平滑肌細胞增殖的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種嚴重威脅人類健康的疾病，特別是心腦血管硬化，在發(fā)達國家屬于死亡率最高的疾病。近年來，我國心腦血管硬化的發(fā)病率也逐年增加。目前，AS缺乏根治性的方法，臨床以降低血脂，調節(jié)脂代謝為主要手段，效果并不理想。大量實驗證明，氧化修飾在AS發(fā)病機制中占有重要地位，越來越受到人們的重視。動脈內膜處的LDL（loW density lipoprotein，LDL）極易受到內膜細胞產生的氧自由基及

2、代謝中間產物的影響，發(fā)生氧化形成氧化型低密度脂蛋白（oxidized low densitv lipoprotein， ox-LDL）。ox-LDL可通過多種途徑損傷血管內皮，促進血管平滑肌細胞（Vascular Smooth Muscle Cells，VSMC）的增殖和泡沫細胞的形成。因此，抑制ox-LDL的生成或降低ox-LDL對機體的損傷是預防AS發(fā)生發(fā)展的關鍵。中藥多糖有很強的生物活性，可調控細胞分裂和分化，具有免疫調節(jié)、抗腫瘤

3、、抗氧化、抗病毒等藥理作用，因此，中藥多糖研究已成為生物化學領域中研究的熱點之一。本實驗主要探討車前子多糖（plantain seed polysaccharide，PSP）對ox-LDL誘導的平滑肌細胞增殖的影響及其機制，為AS的防治提供進一步的理論依據。
　　 一大鼠主動脈平滑肌細胞的體外培養(yǎng)及其鑒定
　　 目的：探討以簡便、高效的方法獲取VSMC，為相關研究提供實驗材料。
　　 方法：（1） VSMC的原代

4、培養(yǎng)：無菌條件下取出胸主動脈，立即置于含有D-Hank's液的培養(yǎng)皿中，去除內膜和外膜，然后將中膜組織剪切成1 mm×1 mm大小的組織塊貼于培養(yǎng)瓶底面。加入含20％胎牛血清的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶倒置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中放置1～2h，待組織塊干涸并與瓶壁貼附，將培養(yǎng)瓶翻轉繼續(xù)靜置培養(yǎng)3～5d。（2） VSMC的傳代培養(yǎng)：待原代培養(yǎng)的細胞達到80％融合時即可進行傳代培養(yǎng)。加入胰蛋白酶消化，將培養(yǎng)瓶放于倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓翻

5、轉培養(yǎng)瓶，吸棄消化液，加入含20％胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，將細胞一分為二接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。（3） VSMC的鑒定：①倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)、貼壁及生長情況。②抗α-平滑肌肌動蛋白免疫組織化學方法鑒定VSMC。
　　 結果：（1）原代細胞生長狀況及形態(tài)學變化：原代培養(yǎng)4～7d，少數(shù)組織塊需繼續(xù)培養(yǎng)至2～3周，可見到組織塊周圍有細胞游出。倒置顯微鏡下觀察，細胞形態(tài)多樣，呈梭形、三角形或不規(guī)則形。胞體較小，大小略有差

6、異。（2）傳代細胞生長狀況及形態(tài)學變化：傳代平滑肌細胞接種于培養(yǎng)瓶12h后，細胞基本都已貼壁生長。培養(yǎng)1～2周左右，形態(tài)多呈梭形，并相互交織排列而呈現(xiàn)典型的“峰-谷”狀生長。（3）抗α-平滑肌肌動蛋白免疫組織化學方法鑒定VSMC；經免疫細胞化學染色后，平滑肌細胞胞漿染成棕黃色，呈陽性反應，高倍鏡下可見胞漿內大量棕黃色、與細胞長軸平行的纖維肌絲，即平滑肌α-肌動蛋白，核卵圓形居中，呈淡藍色。
　　 結論：本實驗采用組織貼塊法成功地

7、培養(yǎng)了VSMC，經光鏡觀察培養(yǎng)的主動脈VSMC具有平滑肌細胞特征，免疫組織化學染色鑒定進一步證實培養(yǎng)的細胞是VSMC。
　　 二車前子多糖對氧化型低密度脂蛋白誘導的大鼠主動脈平滑肌細胞增殖的影響
　　 目的：探討PSP對ox-LDL誘導的大鼠主動脈VSMC增殖的影響及其可能的作用機制。
　　 方法：以ox-LDL誘導大鼠主動脈VSMC體外增殖模型，利用細胞增殖抑制實驗MTT法檢測VSMC增殖程度。生化法測定細胞培

8、養(yǎng)液中丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮合酶（NOS）活性的變化。應用RT-PCR方法檢測c-myc，MCP-1 mRNA的表達。觀察不同濃度PSP對上述指標的影響。
　　 結果：（1） MTT實驗結果表明，ox-LDL可誘導VSMC增殖，與空白對照組相比，差異有顯著性（P<0.01），給予不同濃度的PSP后，低、中、高濃度的PSP組對平滑肌細胞增殖抑制率分別為（10.47±1.07）％，

9、（26.75±2.36）％，（47.68±2.53）％，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。說明PSP對平滑肌細胞的增殖具有抑制作用。
　　 （2）脂質過氧化產物MDA含量的變化：ox-LDL可明顯增加VSMC中MDA含量，空白對照組MDA含量為14.52±1.23 nmol/ml，ox-LDL組MDA含量為26.38±2.59nmol/ml，與空白對照組相比有顯著性差異（P<0.01）。不同濃度的PSP組MDA含量分別為24.19±2.6

10、3、21.97±1.49、19.85±1.78 nmol/ml，與ox-LDL組相比有顯著性差異，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。
　　 （3） SOD活性的變化：ox-LDL可明顯降低細胞的SOD活力，與空白對照組相比差異有顯著性（P<0.01）?？瞻讓φ战MSOD活力為51.67±5.28 U/ml，ox-LDL組SOD活力為35.39±3.15 U/ml，不同濃度的PSP作用后其SOD活力分別為37.16±2.97、40.64±4.

11、76、46.73±5.47 U/ml，可見PSP能增強SOD的活性。
　　 （4） NO含量的變化：ox-LDL可抑制NO的合成和釋放，與空白對照組相比，ox-LDL組NO含量明顯降低。空白對照組NO含量為78.65±6.76 nmol/ml，ox-LDL組NO含量為53.09±3.27 nmol/ml。低、中、高濃度PSP組NO含量分別為58.48±4.54、64.59±5.17、72.61±4.69 nmol/ml，與ox-

12、LDL組相比有顯著性差異（P<0.01）。說明腳可以抑制ox-LDL的效應，增加NO含量。
　　 （5） NOS活性的變化：空白對照組NOS活性為1.56±0.25U/ml，ox-LDL組NOS活性為1.18±0.11 U/ml，與空白對照組相比，ox-LDL組NOS活性明顯降低。低、中、高濃度PSP組NOS活性均比ox-LDL組有所提高，分別為1.29±0.15、1.40±0.18、1.45±0.20 U/ml，與ox-LDL

13、組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但各組之間無劑量依賴性。
　　 （6） VSMC中c-myc mRNA表達的變化：在空白對照組中，VSMC的c-myc mRNA呈現(xiàn)低表達，當加入ox-LDL作用48 h，c-myc mRNA相對表達量，呈現(xiàn)明顯增高。分別加入不同劑量的PSP和ox-LDL共同孵育，PSP能明顯抑制ox-LDL誘導的c-myc mRNA表達，不同濃度PSP組c-myc的相對表達量分別為0.309±0.037

14、、0.286±0.044、0.245±0.038，PSP對c-myc mRNA表達的抑制作用隨劑量增加而有增強趨勢。
　　 （7） VSMC中MCP-1mRNA表達的變化：在空白對照組中，VSMC的MCP-1 mRNA呈現(xiàn)低表達，當加入ox-LDL作用48h后，MCP-1 mRNA相對表達量，呈現(xiàn)明顯增高。預先2h分別加入不同劑量的PSP和ox-LDL共同孵育，PSP能明顯抑制ox-LDL誘導的MCP-1 mRNA表達，各個濃度

15、的PSP組MCP-1的相對表達量分別為0.286±0.042、0.267±0.046、0.239±0.031，PSP對MCP-1 mRNA表達的抑制作用隨劑量增加而有增強趨勢。
　　 結論：（1） PSP對ox-LDL誘導的VSMC增殖有一定的抑制作用，對細胞的抑制率也隨藥物濃度增高明顯增高。（2）PSP具有抗脂質過氧化和抗氧自由基損傷作用，減少脂質過氧化物MDA的生成，提高SOD的活性，這可能是其抑制ox-LDL誘導VSMC增