利用魚類細(xì)胞系篩選抗神經(jīng)壞死病毒(NNV)中草藥的研究.pdf

1、石斑魚廣泛分布于熱帶和亞熱帶海域，是我國重要的海洋經(jīng)濟(jì)魚類。然而在石斑魚繁育生產(chǎn)過程中，病毒性神經(jīng)壞死?。╒NN）常引起石斑魚仔稚魚發(fā)生大規(guī)模死亡事件，死亡率常高達(dá)90％。VNN目前并沒有有效的防治措施，而中草藥具有低毒、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，符合開發(fā)無公害漁藥的特點(diǎn)，因此篩選抗神經(jīng)壞死病毒（NNV）的中草藥具有廣闊的應(yīng)用前景。在藥物篩選的載體選擇中，細(xì)胞系取自于生物體，生物性能基本接近生物個(gè)體特性，相比其他藥物篩選載體，細(xì)胞系可進(jìn)行高通量篩選

2、，符合現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展趨勢。故利用魚類細(xì)胞系篩選抗NNV中草藥具有一定的實(shí)踐和理論價(jià)值。2013年5月份，山東省某繁育場培育的珍珠龍膽石斑魚魚苗由于感染了NNV而出現(xiàn)了大量死亡，給該繁育場帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本論文對導(dǎo)致魚苗患病死亡的病原進(jìn)行了鑒定及測序分析，并利用健康珍珠龍膽石斑魚的腦組織進(jìn)行了細(xì)胞系建系工作，初步探討了該細(xì)胞系與NNV的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，又利用建立的腦組織PB細(xì)胞系和SSN-1細(xì)胞系進(jìn)行了抗NNV中草藥的篩

3、選工作。本論文有如下主要研究結(jié)果：
　　1.疾病病原鑒定及基因測序分析
　　該疾病暴發(fā)的主要流行病學(xué)特點(diǎn)為：患病珍珠龍膽石斑魚體色發(fā)黑，厭食，死亡率達(dá)90%以上，具有一定的季節(jié)性。組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明患病魚體腦組織、神經(jīng)系統(tǒng)及視網(wǎng)膜組織出現(xiàn)大量的空泡化壞死病變。電鏡切片觀察到在神經(jīng)組織中含有大量的20-30nm的病毒顆粒,呈晶格狀排列在細(xì)胞質(zhì)中。另外，使用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的檢測NNV的PCR引物，成功的擴(kuò)增出特異

4、性條帶（421bp）。結(jié)合該疾病的流行病學(xué)，患病魚體的組織病理學(xué)，及分子生物學(xué)確診了導(dǎo)致此次珍珠龍膽石斑魚魚苗患病死亡的病原體為NNV。在確定致病病原的基礎(chǔ)上，利用四對引物成功的擴(kuò)增出NNV含有的RNA1和RNA2的基因序列，并上傳到GenBank中（獲得的登陸號分別為：KF668184、KF668183），利用DNA star軟件分析后表明此RNA1和RNA2的開放閱讀框(ORF)分別編碼982和338個(gè)氨基酸。其基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析表

5、明該分離獲取的NNV基因型屬于RGNNV型。該基因型為我國內(nèi)陸常見基因型，為后續(xù)的藥物篩選提供了典型的病毒來源。
　　2.細(xì)胞系建立及對NNV的敏感性
　　為了盡可能的排除不同來源病毒株在感染魚體過程中的宿主特異性，本研究直接利用健康珍珠龍膽石斑魚的腦組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并成功建系暫命名為PB細(xì)胞系。通過對PB細(xì)胞系生長條件（FBS含量、生長因子）的研究表明該細(xì)胞系在含有微量bFGF因子和10%FBS的1.5×L-15細(xì)胞培養(yǎng)

6、液中貼壁生長良好。使用一定量的病毒粗提液添加到該細(xì)胞系后，雖然沒有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞皺縮、變圓、脫落等典型的細(xì)胞病變（CPE），但細(xì)胞經(jīng)Hoechst染色后，細(xì)胞核出現(xiàn)了一定程度的顆粒濃染現(xiàn)象，表明了病毒對該細(xì)胞系有一定的影響，細(xì)胞出現(xiàn)了輕微的退性病變，但表現(xiàn)在細(xì)胞總體上的CPE，并不明顯。后續(xù)進(jìn)行的相對熒光定量結(jié)果也表明了NNV在細(xì)胞中有一定的增殖。本試驗(yàn)成功建立的PB細(xì)胞系增加了現(xiàn)存有限魚類細(xì)胞系的數(shù)量及種類，而NNV與PB細(xì)胞系之間的

7、相互作用為研究病毒與宿主之間的關(guān)系提供了一定的理論參考。
　　3.抗NNV中草藥的篩選
　　通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)獲得50種具有抗病毒作用的中草藥，采取傳統(tǒng)的煎煮法粗提制備，5倍稀釋后，檢測對SSN-1細(xì)胞系的大致安全濃度。在各中草藥安全濃度下與一定量的病毒粗體液在4℃下混合處理24小時(shí)。加入SSN-1細(xì)胞系中，7天后觀察SSN-1細(xì)胞系出現(xiàn)的CPE差異。利用CPE差異篩選出6種相對有效的中草藥，分別對應(yīng)的編號為H-15，H-22

8、，H-27，H-33，H-37，H-45。此外，檢測了H-15，H-22，H-27，H-33，H-37，H-45中草藥對PB細(xì)胞系的安全濃度，并在安全濃度下與病毒粗提液混合處理作用于PB細(xì)胞系，用于NNV用藥后在PB細(xì)胞中的相對熒光定量測定。結(jié)果表明，編號為H-15，H-22，H-27，H-33，H-37，H-45的中草藥對NNV的增殖有一定的抑制作用。本部分研究結(jié)果為NNV引起的VNN的防控提供了一定的參考性藥物，具有一定的實(shí)踐生產(chǎn)意