牛腸道病毒2型VP1+蛋白的原核表達(dá)及其ELISA檢測技術(shù)研究.pdf

1、 Prokaryotic Expression of Protein VP1+ and Establishment of ELISA Detection Method for the Bovine Enterovirus Type 2 Thesis submitted to Qingdao Agricultural University In Fulfillment of the Requirement For the Degree

2、 of Master of Agronomy Guo Jin-yu （Department of Animal Science and Veterinary Medicine） Supervisor: Prof. Zhang Lecui Res. Zhang Hexiao Qingdao. China June, 2015 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文

3、 摘要 牛腸道病毒 2 型 VP1+蛋白的原核表達(dá)及其ELISA 檢測技術(shù)研究 摘 要 本研究根據(jù) 2005 年從北京某牛場分離得到的一株牛腸道病毒 2 型（Bovine enterovirus type 2, BEV-2）毒株序列，設(shè)計(jì)了一對特異性引物，采用 RT-PCR 方法，擴(kuò)增牛腸道病毒 2 型包含 VP1（840bp）蛋白基因片段的 VP1+（1275bp）序列，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到 pMD-T19。驗(yàn)證該序列為目的片段

4、后，將其克隆到表達(dá)載體 pET-32a。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 Rosetta，經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)后，SDS-PAGE 顯示重組蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)。 將重組蛋白作檢測抗原包被酶標(biāo)板， 成功建立了檢測牛腸道病毒 2 型抗體的間接 ELISA 方法，為下一步 BEV-2 單克隆抗體的制備打下了基礎(chǔ)。 將純化的牛腸道病毒 2 型（BEV-2）VP1+重組蛋白接種 BALB/c 小鼠，取其脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0 用 PEG4000 進(jìn)

5、行融合。通過對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選，最終獲得 2 株穩(wěn)定分泌抗 BEV-2 VP1+蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（1G1、5G6） 。 用制備的單克隆抗體包被酶標(biāo)板，通過一系列的優(yōu)化，建立了 BEV-2 雙抗夾心 ELISA 檢測方法。該方法檢測 BEV-2 病毒量的最低限為 100TCID50/0.1mL，與 BVDV、IBRV、BLV 等病毒無交叉。結(jié)果表明雙抗夾心 ELISA 檢測方法特異強(qiáng)、敏感性高，并且重復(fù)性好。本研究