MMP-9在人動(dòng)脈硬化組織中表達(dá)及影響因素探討.pdf

1、研究目的：動(dòng)脈硬化發(fā)生、發(fā)展是復(fù)雜并受多種因素影響的慢性過(guò)程。病人病情穩(wěn)定與否不僅與動(dòng)脈硬化管腔狹窄程度有關(guān)，與斑塊炎癥是否活躍更密切相關(guān)。炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子參與動(dòng)脈硬化斑塊變化的病理過(guò)程?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MatrixMetalloProteinase—9 MMP—9)在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中起到了重要作用，MMP—9降解膠原，減弱動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中纖維帽強(qiáng)度，導(dǎo)致了斑塊不穩(wěn)定性增加，從而促進(jìn)急性冠脈綜合癥等的發(fā)病。本項(xiàng)研究觀察基質(zhì)金

2、屬蛋白酶9在人動(dòng)脈硬化組織中的表達(dá)，探討胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF—1)、腫瘤壞死因子(TNF—α)、白介素1βB(IL—1β)、單核細(xì)胞趨化因子—1(MCP—1)及他汀藥物對(duì)其表達(dá)的影響。
　　 研究方法：動(dòng)脈硬化組織取自擇期開放外科手術(shù)標(biāo)本，術(shù)后病理檢查證實(shí)為動(dòng)脈硬化組織。對(duì)照組動(dòng)脈標(biāo)本取自非正常死亡成人標(biāo)本，經(jīng)大體和鏡下病理檢查證實(shí)為正常主動(dòng)組織。所有標(biāo)本4％多聚甲醛固定12h，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片。HE染色及標(biāo)準(zhǔn)免疫組織

3、化學(xué)染色檢測(cè)。
　　 人血管平滑肌細(xì)胞取自外科開放手術(shù)標(biāo)本，細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、收集、凍存、復(fù)蘇，以RT—PCR和Western blot技術(shù)測(cè)定不同濃度TNF—α誘導(dǎo)下血管平滑肌細(xì)胞中MMP—9 mRNA和蛋白的表達(dá)；不同濃度匹伐他汀對(duì)TNF—α的干預(yù)作用。
　　 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷：由兩位以上病理醫(yī)師采用雙盲法觀察每張切片。判定陽(yáng)性反應(yīng)依據(jù)：按光鏡下(×400)隨機(jī)選10個(gè)不重復(fù)視野，按陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分：<25％定

4、為陰性(0分)，26％～50％定為弱陽(yáng)性(1分)，51％—75％定為中度陽(yáng)性(2分)，>76％—100％為強(qiáng)陽(yáng)性(3分)。
　　 RT—PCR判斷方法：紫外線燈下觀察照相，同時(shí)出現(xiàn)內(nèi)參及目的基因條帶為陽(yáng)性。僅出現(xiàn)內(nèi)參者為陰性。掃描儀進(jìn)行灰度掃描，Image Tool Version2．0軟件分析結(jié)果。
　　 Western blot檢測(cè)判斷方法：掃描儀進(jìn)行灰度掃描，Image Tool Version2．0軟件分析結(jié)果，

5、以各檢測(cè)蛋白和β—actin掃描灰度的比值作為評(píng)價(jià)各蛋白表達(dá)水平的指標(biāo)。
　　 結(jié)果：正常腹主動(dòng)脈壁內(nèi)未見明顯MMP—9、MCP—1、IL—1β分布，TNF—α、IGF—1染色呈陽(yáng)性或弱陽(yáng)性；動(dòng)脈硬化組織中MMP—9主要分布在動(dòng)脈壁中膜、外膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)，呈片狀或連續(xù)分布，MCP—1出現(xiàn)在排列紊亂的炎性細(xì)胞聚集處，陽(yáng)性細(xì)胞多為成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞；IGF—1在動(dòng)脈硬化組織中染色呈弱陽(yáng)性或陰性，淺棕黃色陽(yáng)性染色偶見于散在分布的血管

6、平滑肌細(xì)胞內(nèi)。IL—1βTNF—α在正常主動(dòng)脈無(wú)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，偶有淺棕黃色染色分布于血管平滑肌細(xì)胞中，在動(dòng)脈粥樣硬化組織中分布主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞及增生的血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)。TNF—α分布主要位于血管中膜、外膜，及血管壁中的巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域。MMP—9分布與MCP—1、TNF—α、IL—1β分布呈正相關(guān)，與IGF—1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；分布有顯著或極顯著差異。
　　 TNF—α呈濃度依賴方式(1/10/100ng/ml)增加

7、血管平滑肌細(xì)胞MMP—9 mRNA和蛋白的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0．01)。不同濃度匹伐他汀(0．1、1、10、100、500nm)可拮抗TNF—α(100ng/ml)促血管平滑肌細(xì)胞MMP—9 mRNA和蛋白的表達(dá)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。
　　 結(jié)論：人動(dòng)脈硬化組織中均有MMP—9、TNF—α、MCP—1、IGF—1、IL—1β的表達(dá)，但分布不同；TNF—α增加血管平滑肌細(xì)胞MMP—9的表達(dá)，匹伐他汀可拮抗