RAPD技術(shù)在廣西產(chǎn)絞股藍(lán)遺傳特征及鑒別中的應(yīng)用研究.pdf

1、采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對廣西區(qū)不同產(chǎn)地、不同來源的7份絞股藍(lán)材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并在DNA分子水平上鑒別絞股藍(lán)及其偽品烏蘞莓的新鮮品、干品，從而為絞股藍(lán)資源的分析收集、分類研究、多樣性保護(hù)、偽品鑒別，進(jìn)而為藥用植物資源的育種工作和臨床安全用藥提供技術(shù)保障及分子生物學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1.采用改進(jìn)的CTAB法成功提取了絞股藍(lán)和烏蘞莓新鮮品、干品DNA。 2.優(yōu)化了絞股藍(lán)的RAPD-PCR反應(yīng)體系：主要以校園

2、采集的絞股藍(lán)DNA為模板，采用隨機(jī)引物WGS001進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對反應(yīng)體系包括模板、Mg2+、Taq酶、牛血清白蛋白(BSA)、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的反應(yīng)體系總體積25μL，含MgCl2 2 mmol/L、dNTP0.2 mmol/L、引物0.4μmol/L、模板60 ng、Taq酶1U、BSA 2μg/L。反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃ 3min，然后94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，40個循環(huán)，72℃延伸

3、10 min。 3.采用優(yōu)化了的RAPD-PCR反應(yīng)體系，從10條含20個堿基的隨機(jī)引物中篩選出了2條具有多態(tài)性高且重復(fù)性好的引物對廣西區(qū)不同產(chǎn)地、不同來源的7份絞股藍(lán)新鮮品材料進(jìn)行RAPD指紋圖譜研究。兩條引物共擴(kuò)增出33個位點，多態(tài)位點30個，占90.91％，說明絞股藍(lán)種內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性。應(yīng)用SPSS16.0軟件計算Jaccard遺傳相似系數(shù)并進(jìn)行聚類分析。絞股藍(lán)植物間的相似性系數(shù)分布較廣，范圍為0.217～0.688

4、。聚類樹狀圖表明絞股藍(lán)親緣關(guān)系與地理距離相關(guān)，地理分布距離越近的樣品，在聚類樹狀圖上的距離越近，說明它們之間的遺傳背景差異越小，親緣關(guān)系越近，反之越遠(yuǎn)。 4.應(yīng)用篩選的兩條引物對廣西不同產(chǎn)地絞股藍(lán)及其偽品烏蘞莓的新鮮品和干品進(jìn)行RAPD鑒別。根據(jù)DNA圖譜上的差異性條帶可以將絞股藍(lán)及其偽品烏蘞莓很好的區(qū)分開來。且兩條引物均能擴(kuò)增出所有絞股藍(lán)新鮮品和干品共有而烏蘞莓沒有的特異DNA片段，WGS001擴(kuò)增的特異片段約550bp，W

5、GS004擴(kuò)增的特異片段約500 bp。初步認(rèn)為可將這兩條特異DNA片段作為鑒別廣西產(chǎn)絞股藍(lán)與烏蘞莓的依據(jù)。 5.對用引物WGS004擴(kuò)增7份絞股藍(lán)新鮮品共有特異DNA片段(約500 bp)進(jìn)行克隆、測序、生物信息學(xué)分析。進(jìn)行生物信息學(xué)分析后確定所克隆的7條DNA序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中未收錄，為新發(fā)現(xiàn)的序列。 本研究首次采用RAPD技術(shù)對廣西產(chǎn)絞股藍(lán)進(jìn)行遺傳特征研究，為研究絞股藍(lán)遺傳多樣性提供了分子生物學(xué)