黑青斑河鲀ISKNV感染模型的建立及蛋白質(zhì)組分析.pdf

1、黑青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)作為重要的模式生物，具有其他模式生物無法比擬的特點和優(yōu)勢。黑青斑河鲀的基因組是已測序脊椎動物中最小的(～350 Mb)，僅是人基因組的1/8、是斑馬魚基因組的1/4，而且跟人基因組結(jié)構(gòu)相似、基因數(shù)目相當(dāng)，因此，黑青斑河鲀的基因組序列已經(jīng)很好地用于比較分析人的基因組，而且對人的新基因評注起了很好的作用。但是，有關(guān)黑青斑河鲀的免疫學(xué)和病理學(xué)研究還處于初級階段，僅僅克隆出了一些重要的細

2、胞因子，尚沒有系統(tǒng)的免疫學(xué)研究。傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)對我國重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類鱖的養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，為了更好地研究ISKNV-宿主相互作用機理，本文建立了黑青斑河鲀感染ISKNV模型，并對感染黑青斑河鲀進行了蛋白質(zhì)組分析，為研究病毒與宿主間感染與抗感染之間的相互作用，尤其是抗病毒免疫研究提供了很好的研究平臺。
　　 本論文借助一系列的實驗動物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方法成功地建立了黑青斑河鲀

3、ISKNV感染模型，并進行了一系列的鑒定工作。發(fā)現(xiàn)黑青斑河鲀感染ISKNV后，沒有出現(xiàn)明顯的感染癥狀，也沒有死亡現(xiàn)象；在基因組水平上，發(fā)現(xiàn)MCP存在于感染黑青斑河鲀脾臟中，并隨感染時間的延長而呈增加的趨勢；在轉(zhuǎn)錄水平上，發(fā)現(xiàn)MCP在感染3天后開始大量轉(zhuǎn)錄，并在第5天時達到高峰；通過HE染色，主要的感染器官脾和腎發(fā)現(xiàn)有輕度的病理變化，其它幾個內(nèi)臟組織均出現(xiàn)明顯的缺血現(xiàn)象，沒有出現(xiàn)明顯的病理變化；通過免疫組化和免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)脾和腎是主要

4、的感染器官，肝、心、鰓、腸和性腺是次要的感染器官，眼睛中沒有發(fā)現(xiàn)感染現(xiàn)象；對主要的感染器官脾臟做不同感染時段的免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)3天時已經(jīng)出現(xiàn)明顯的感染現(xiàn)象，在第6天時感染最明顯，第8天時開始降低很多，第10天之后感染現(xiàn)象消失；電鏡結(jié)果分析表明，在感染8天的脾臟中發(fā)現(xiàn)大量的病毒粒子存在；對黑青斑河鲀主要免疫相關(guān)基因的Real time PCR分析結(jié)果表明，ISKNV感染啟動了黑青斑河鲀體內(nèi)的TNF-a相關(guān)通路和IFN通路，抗炎因子IL-

5、10起到了很好的減少組織損傷作用。
　　 在蛋白質(zhì)組分析上，取健康黑青斑河鲀和ISKNV感染第6天黑青斑河鲀的脾臟做蛋白質(zhì)組分析，共發(fā)現(xiàn)有60個差異的蛋白點，質(zhì)譜測序測出40個差異的蛋白點，這40個點對應(yīng)黑青斑河鲀的35個蛋白，有23點是下調(diào)的，17個點是上調(diào)的。有11個點是細胞骨架蛋白(2個beta-actin、Capping protein(actin filament)muscl、2個Kerain8、Cofilin-2、V

6、acuolar protein sorting29(VPS29)、Actin related protein2/3 complex，subunit2(Arp2/3)、Sept2 protein、Sept8a protein、和type I keratinS8)，7個點是代謝相關(guān)的蛋白(Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase2(PRS2)、Methylthioadenosine phosphoryl

7、ase(MTAP)、Malate debydrogenase(MDH)、GlycineN-methyltransferase(GNMT)、Enolase和2個Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase(GAPDH))，7個點是離子/分子運輸相關(guān)的蛋白(2個Hemoglobinbeta subunit、Carbonic anhydrase(CA)、Chloride intracellular channe

8、l1(CLIC1)、Ferritin、Annexin A4(Anx A4)和V-ATPase subunit A)，5個點參與抗氧化作用(Natural killer enhancing factor(NKEF)、Glutathione peroxidase(GPX)、Catalase和2個2-Cys peroxiredoxin(2-Cys Prx))，1個點屬于還原酶類(Biliverdin reductase(BVR))，2個點是R

9、ho GTPase家族的信號分子(Cell division cycle42(CDC42)和Ras-related C3 botulinum toxin substrate2)，1個點是UPP通路的蛋白(20Sproteasome beta subunit)，5個點是其它功能蛋白(1-isoaspartyl protein carboxyl、methyltransferase(PIMT)、Tissue specific transpla

10、ntation antigen P35B、CathepsinD、SET translocation、Tyrosine3-monooxygenase/tryptophan5-monoox...(YWHAZ)和Chymotrypsin B precursor)。Real time PCR對這35個蛋白進行驗證，有48.6％的蛋白兩種結(jié)果相符。
　　 根據(jù)這些蛋白的變化情況分析，可以得出以下結(jié)論：1)細胞骨架在感染時發(fā)生了很大的變化，

11、β-actin可能參與了病毒的感染、合成和擴散。2)三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑均增強，能量代謝功能提升。3)感染激活了鐵蛋白的翻譯活性，可能減少了病毒感染時對血管系統(tǒng)的損傷。4)2-Cys Prx是ISKNV感染時起主要抗氧化作用的酶類。5)Rac2和Cdc42可能導(dǎo)致了感染時的溶血性貧血癥，參與ISKNV引起的血管結(jié)構(gòu)變化。6)UPP活性的降低，可能導(dǎo)致ISKNV復(fù)制障礙。7)推測Rac2、Cdc42和NKEF可能是ISKNV感染時重要的