鼻咽癌可視化動物模型的建立.pdf

1、分子影像學可實現(xiàn)在活體生物內(nèi)細胞、基因和分子水平的生理或病理過程的實時動態(tài)無創(chuàng)成像，其中光學成像技術(shù)中的熒光技術(shù)和生物發(fā)光技術(shù)發(fā)展迅速，已廣泛應用于各類腫瘤可視化動物模型中，為研究活體內(nèi)腫瘤細胞與其周圍環(huán)境相互作用過程，提供了一種全新的監(jiān)測方法，為更清晰和深入地了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移提供了良好的平臺。
　　鼻咽癌(NPC)是東南亞、特別是我國南方數(shù)省常見的惡性腫瘤，作為一種有著鮮明特點的頭頸部腫瘤，其呈低分化，惡性程度高，

2、早期即可出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。建立人鼻咽癌可視化動物模型，能促進對鼻咽癌分子機制及診斷治療的深入研究。
　　首先，我們采用脂質(zhì)體法將熒光蛋白和熒光素酶基因表達質(zhì)粒（pEGFP-N1、p GL3-Control、Luc-DsRed2）導入人鼻咽癌細胞株中（5-8F、6-10B、CNE1-LMP1、C666-1），利用G418或潮霉素進行壓力篩選。經(jīng)過20多天的篩選，我們挑取單獨穩(wěn)定表達熒光蛋白、單獨穩(wěn)定表達熒光素酶及同時穩(wěn)定表達熒光蛋

3、白和熒光素酶的亞克隆細胞株。其中具代表性的細胞株有:單獨穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的5-8F-GFP-F細胞株、單獨穩(wěn)定表達熒光素酶的5-8F-Luc-Z、同時表達綠色熒光蛋白和熒光素酶的5-8F-Luc-GFP-M及同時表達紅色熒光蛋白和熒光素酶的CNE1-LMP1-Luc-DsRed2-E細胞株。接著，我們分別利用上述4株細胞，通過皮下接種技術(shù)及裸鼠鼻咽原位接種技術(shù)，分別建立了裸鼠皮下移植瘤和裸鼠鼻咽原位移植瘤可視化動物模型。
　　

4、結(jié)果證實:5-8F-GFP-F細胞株和5-8F-Luc-Z細胞株在裸鼠皮下和鼻咽部均具有較好的成瘤能力，并能穩(wěn)定表達目的基因綠色熒光蛋白或者熒光素酶。在精諾真IVIS LuminaⅡ成像系統(tǒng)下，兩株細胞都分別成功的建立了裸鼠皮下移植瘤及鼻咽原位移植瘤可視化動物模型。5-8F-GFP-F細胞株穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白，皮下移植瘤熒光信號定位清晰，能準確的反映皮下腫瘤體積大小及生長情況;與之相對應的鼻咽原位移植瘤可視化動物模型中，則需將裸鼠口腔

5、打開，才能夠采集到熒光信號，從而實現(xiàn)對鼻咽原位腫瘤的實時、動態(tài)監(jiān)測，這可能與裸鼠鼻咽腔周圍解剖結(jié)構(gòu)復雜及GFP深層組織穿透能力有限等因素有關(guān)。此外，裸鼠毛發(fā)等存在自發(fā)熒光干擾信號，這些因素，在一定程度上影響了GFP的適用范圍。在5-8F-Luc-Z細胞株建立的可視化動物模型中，腹腔注射熒光素酶底物D-Luciferin后，無論是裸鼠皮下移植瘤還是鼻咽原位移植瘤，均能采集到很強的熒光信號，定位準確、清晰、亦可實時、動態(tài)監(jiān)測腫瘤的生長情況。

6、與GFP相比，熒光素酶靈敏度更高、深層組織穿透能力更強、幾乎無干擾背景，其建立的鼻咽癌可視化動物模型具有其獨特之處。與此同時，為結(jié)合GFP和Luc兩者的優(yōu)點，我們通過共轉(zhuǎn)染方式將GFP和Luc兩者同時標記5-8F-Luc-GFP-M細胞株，并建立了相應可視化動物模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn):兩種熒光均沒有檢測到，可能與綠色熒光蛋白和熒光素酶的表達水平均偏低有關(guān)，表明通過共轉(zhuǎn)染方式結(jié)合兩者，并應用于可視化動物模型的建立，有一定困難。此外，我們還將紅色熒

7、光蛋白和熒光素酶兩者整合到同一個載體Luc-DsRed2上，篩選出穩(wěn)定細胞株CNE1-LMP1-Luc-DsRed2-E并建立了相應的人鼻咽癌可視化動物模型。結(jié)果進一步證實:熒光素酶是很好的腫瘤細胞示蹤劑，無論體外還是體內(nèi)水平熒光素酶均能夠準確示蹤腫瘤細胞，且細胞數(shù)越多，產(chǎn)生的熒光信號越強;紅色熒光蛋白可能受基因本身表達水平、組織穿透能力及儀器靈敏度的多種因素影響，體內(nèi)水平監(jiān)測受限。
　　最后，我們在CNE1-LMP1-Luc-D

8、sRed2-E細胞株建立的人鼻咽癌可視化動物模型基礎上，將臨床鼻咽癌一線治療藥物順鉑應用到該模型中，比較了順鉑治療前后，鼻咽原位腫瘤熒光信號強度的變化情況，并用TUNEL實驗檢測腫瘤組織的凋亡情況。研究證實:順鉑能有效抑制鼻咽癌的生長，并能通過誘導腫瘤細胞的凋亡來治療鼻咽癌。此外，還發(fā)現(xiàn)鼻咽癌對局部顱底骨組織有侵襲作用，可能與LMP1相關(guān)。
　　綜上，本研究以多株穩(wěn)定表達熒光蛋白和熒光素酶的人鼻咽癌克隆細胞株為基礎，通過建立人鼻咽