應(yīng)用原子力顯微鏡對(duì)不同程度貧血狀態(tài)人體口腔鱗狀上皮細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)的觀察與分析.pdf

1、目的:本研究目的在于應(yīng)用原子力顯微鏡深入觀察不同程度貧血患者口腔黏膜鱗狀上皮細(xì)胞表面的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變,對(duì)細(xì)胞膜表面特性進(jìn)行分析,探討細(xì)胞表面膜結(jié)構(gòu)的變化與人體健康狀態(tài)的關(guān)系,為原子力顯微鏡的臨床試驗(yàn)應(yīng)用提供一定可供參考的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1：分組評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)
　　 按血紅蛋白濃度劃分為4組:對(duì)照組:男性Hb:120～160g/L,女性(非妊娠)Hb:110～150g/L;輕度貧血組Hb:90～109g

2、/L;中度貧血組Hb:60～89g/L;重度貧血組Hb:30～59g/L。
　　 2：受檢者納入標(biāo)準(zhǔn)
　　 (1)年齡為20歲-35歲;
　　 (2)無口腔黏膜疾患病史;
　　 (3)口腔內(nèi)無局部刺激因素;
　　 (4)全身無與放射性物質(zhì)或有毒化學(xué)物質(zhì)接觸史;
　　 (5)無吸煙史;
　　 (6)均經(jīng)過協(xié)商同意受檢口腔黏膜鱗狀上皮細(xì)胞。
　　 3：AFM標(biāo)本的制備
　

3、　 受檢者按血紅蛋白濃度劃分為4組:即對(duì)照組、輕度貧血組、中度貧血組、重度貧血組,每組收集30例,每人2張細(xì)胞涂片樣品,各樣品選擇5個(gè)細(xì)胞,每個(gè)細(xì)胞選擇膜表面亮度變化較大的一個(gè)5μm區(qū)域,即每組共300個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)。
　　 囑受檢者清潔口腔后,經(jīng)過消毒的木質(zhì)壓舌板,輕刮取受檢者口腔內(nèi)側(cè)頰黏膜。將第2次刮取物用2％甲醛溶液沖洗入5mL離心管內(nèi),固定約20 min。然后將離心管置于離心機(jī),以1000 r/min離心10 min,棄去

4、上清液,重復(fù)1次。將細(xì)胞懸液輕輕涂于已經(jīng)處理好的潔凈載玻片上,置于超凈工作臺(tái)晾干備用。
　　 4：AFM操作方法
　　 本研究應(yīng)用AFM在"tapping"(接觸)模式,大氣環(huán)境和室溫條件下對(duì)人體口腔鱗狀上皮細(xì)胞進(jìn)行觀察,描繪出樣本表面原子級(jí)分辨率的三維圖像。
　　 取晾干的樣本切片輕放于AFM載物臺(tái)上,選擇分散比較均勻的細(xì)胞,置于視野中央接近探針的位置。手動(dòng)調(diào)節(jié)掃描探頭激光點(diǎn),與針尖重合,保證激光光斑、屏幕中心

5、圓點(diǎn)、探針尖三點(diǎn)重合。
　　 于每個(gè)涂片樣本上掃描10個(gè)細(xì)胞,掃描范圍500nm～90μm,掃描頻率為0.5Hz和2Hz。選取5μm區(qū)域圖像,利用最新版AFM圖像分析軟件Nanoscope5.31r1對(duì)圖像進(jìn)行處理分析,記錄圖像Hight(高度圖)和Amplitude(振幅圖)的Ra(平均粗糙度)2個(gè)參數(shù)的具體測量值,匯總。
　　 5：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示

6、,多組間比較采用方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1：病理細(xì)胞學(xué)結(jié)果
　　 經(jīng)武警總醫(yī)院病理科兩名病理診斷醫(yī)師在光鏡下檢查各組口腔鱗狀上皮細(xì)胞涂片,對(duì)照組口腔鱗狀上皮細(xì)胞,與輕度貧血、中度貧血和重度貧血患者的口腔鱗狀上皮細(xì)胞的HE巳染色結(jié)果,四幅圖對(duì)照,并不能觀察出明顯的差異。
　　 2： AFM細(xì)胞掃描圖應(yīng)用
　　 原子力顯微鏡分別觀察對(duì)照組和貧血組的口腔鱗狀上皮細(xì)

7、胞。對(duì)照組鱗狀上皮細(xì)胞膜表面隆起光滑、飽滿,排列疏密有度,各隆起間形成的縫隙狀凹陷深度較為均勻;而輕度、中度、重度貧血組細(xì)胞表面隆起粗糙程度逐漸增加。重度貧血組患者的細(xì)胞則可觀察到明顯蟲蝕樣孔洞出現(xiàn)。
　　 對(duì)局部5μm圖像中的高度圖(Height)和振幅圖(Amplirode)進(jìn)行平滑度處理,分別得出平均粗糙度Ra值,輕度、中度、重度貧血組與對(duì)照組相比,Ra值明顯增加。
　　 3：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果
　　 全部數(shù)據(jù)

8、分為4個(gè)組:對(duì)照組、輕度貧血組、中度貧血組、重度貧血組,對(duì)高度圖(Height)和振幅圖(Amplitude)中的平均粗糙度Ra值和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)的形式表示。對(duì)照組Ra值分別為18.8411±0.427,11.011±0.106;輕度貧血組39.4683±0.863,14.164±0.563;中度貧血組為67.5262±1.062,17.344±0.673;重度貧血組

9、106.6947±1.915,22.984±0.763。
　　 四組細(xì)胞膜表面的平均粗糙度比較有顯著性差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 在原子力顯微鏡下,人體口腔黏膜鱗狀上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu),隨著貧血程度的加深表現(xiàn)出不同程度的改變,細(xì)胞膜表面的平均粗糙度Ra值呈現(xiàn)增加的趨勢。在重度貧血組的整個(gè)細(xì)胞的Height(高度圖)上可以看到如蟲蝕狀的孔洞出現(xiàn)。初步觀察出貧血在口腔鱗狀上皮細(xì)胞的