GADA、IA-2A微量平板放射結(jié)合檢測(cè)法的建立與臨床應(yīng)用.pdf

1、背景： 1型糖尿病(T1DM)患者或前期個(gè)體血清中存在多種自身抗體，采用放射配體法(RLA)檢測(cè)谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)和蛋白酪氨酸磷酸酶-2自身抗體(IA-2A)能正確指導(dǎo)T1DM分型與治療，同時(shí)也能有效預(yù)測(cè)TIDM的發(fā)生。然而RLA不易于自動(dòng)化和不適應(yīng)于大樣本的檢測(cè)，且檢測(cè)成本偏高，臨床應(yīng)用受到限制。 目的： 建立GADA、IA-2A微量平板放射結(jié)合檢測(cè)法(RBA)，初步評(píng)價(jià)其臨床應(yīng)用價(jià)值。嘗試采用該法檢

2、測(cè)末梢血中GADA和IA-2A，為今后應(yīng)用于TIDM的篩查和預(yù)測(cè)提供基礎(chǔ)，并降低檢測(cè)成本。 方法： 1.方法建立采用重組人GAD65(或IA-2)質(zhì)粒，經(jīng)試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄與翻譯，獲得35S-GAD65抗原(35S-IA-2抗原)。經(jīng)Sephadex G-25柱純化并稀釋的35S-GAD65抗原(35S-IA-2抗原)與2μl血清在V形底96孔平板中緩慢振蕩孵育24h，而后轉(zhuǎn)入已包被蛋白A的Millipore平板中。采用4℃ P

3、BS緩沖液洗滌抗原抗體復(fù)合物。并采用多功能液體閃爍發(fā)光儀計(jì)數(shù)，結(jié)果以WHO標(biāo)準(zhǔn)單位表示。 2.檢測(cè)條件優(yōu)化分析固定其他檢測(cè)條件不變，分別對(duì)標(biāo)記抗原的純化方式、加入的放射性計(jì)數(shù)值、血清與標(biāo)記抗原孵育時(shí)間、沉淀物洗滌次數(shù)和閃爍液型號(hào)的選擇進(jìn)行優(yōu)化分析。 3.方法評(píng)價(jià)對(duì)方法的變異情況、重復(fù)性、線(xiàn)性與檢測(cè)限、回收率等進(jìn)行評(píng)估；盲法檢測(cè)由美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)提供的150例DASP 2005標(biāo)本評(píng)價(jià)方法的靈敏度和特異性；評(píng)

4、價(jià)脂血、黃疸以及溶血對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；評(píng)價(jià)其他自身免疫疾病(Graves病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的交叉反應(yīng)；與經(jīng)典RLA法比較，評(píng)價(jià)方法的一致性。 4.臨床應(yīng)用檢N224例正常人GADA和IA-2A濃度，確定陽(yáng)性閾值。并檢測(cè)162例TIDM和210例新診T2DM患者GADA和IA-2A濃度，評(píng)估臨床應(yīng)用效果。 5.末梢血檢測(cè)對(duì)35例TIDM患者、24例T2DM患者和32例正常人同時(shí)采集靜脈血和手指

5、血，比較檢測(cè)結(jié)果的一致性。 6.成本分析對(duì)微量平板RBA法與經(jīng)典RLA法檢測(cè)成本進(jìn)行比較。 結(jié)果： 1.優(yōu)化的檢測(cè)條件包括采Sephadex G-25柱凝膠過(guò)濾層析法純化標(biāo)記抗原，2μl血清與放射性計(jì)數(shù)為3×104標(biāo)記抗原緩慢振蕩孵育24h，采用4℃PBS緩沖液洗滌沉淀物10次，以及采用OptiphaseSupermix型閃爍液進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)。 2.該法檢測(cè)GADA批內(nèi)CV為3.8％～10.2％，批間CV

6、 5.6％～11.9％。檢測(cè)IA-2A批內(nèi)CV為4.1％～10.0％，批間CV 5.7％～12.8％：間隔1月的3次重復(fù)檢測(cè)，GADA和IA-2A濃度差異無(wú)顯著性(P均>0.05)，所測(cè)標(biāo)本陰、陽(yáng)性結(jié)果判斷完全一致；WHO標(biāo)準(zhǔn)品濃度在15.63～250 IU/ml范圍內(nèi)，血清樣品GADA在40.3～664 IU/ml，IA-2a在53-848 IU/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。GADA檢測(cè)限為3.6IU/ml，IA-2A檢測(cè)限為0.54 IU/

7、ml；該法檢NGADA回收率為71.9％～122.8％，IA-2A回收率為72.0％-133.3％；DASP 2005結(jié)果顯示，檢測(cè)GADA靈敏度為78％，特異性為98％。檢測(cè)IA-2A靈敏度為72％，特異性為98％；血清標(biāo)本TG濃度≤5.8mmol/L，TBIL濃度≤67.1μmol/L，血漿中Hb濃度≤5.3g/L下，對(duì)GADA和IA-2A檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著影響；交叉反應(yīng)顯示，50例Graves病患者中GADA陽(yáng)性2例，12例系統(tǒng)性紅斑

8、狼瘡患者GADA陽(yáng)性1例，20例類(lèi)風(fēng)濕因子陽(yáng)性的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中GADA陽(yáng)性1例。IA-2A在上述3種自身免疫性疾病中均未檢測(cè)出陽(yáng)性；微量平板RBA檢測(cè)GADA與經(jīng)典RLA法結(jié)果判定一致率97.5％，Kappa值0.95；檢測(cè)IA-2A與經(jīng)典RLA法結(jié)果判定一致率96.5％，Kappa值0.92。 3.該法檢測(cè)GADA和IA-2A陽(yáng)性閾值分別為40.0 IU/ml和9.2IU/ml(均為224例正常人的99％百分位點(diǎn))；檢測(cè)T

9、1DM患者GADA陽(yáng)性率為46.9％，明顯高于正常人的0.89％(P<0.001)。檢測(cè)T1DM患者IA-2A陽(yáng)性率22.8％，也明顯高于正常人的0.89％(P<0.001)；檢測(cè)T2DM患者GADA陽(yáng)性率為5.2％，顯著高于正常人的0.89％(P<0.01)。而IA-2A在T2DM患者中陽(yáng)性率2.4％，與正常人相比，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。 4.微量平板RBA法檢測(cè)手指血GADA與經(jīng)典RLA法檢測(cè)靜脈血結(jié)果判定一致率96

10、.7％，Kappa值0.905。檢測(cè)IA-2A結(jié)果判定一致率100％；微量平板RBA法檢測(cè)手指血與靜脈血GADA和IA-2A結(jié)果判定一致率均為100％。 5.微量平板RBA法檢測(cè)單例抗體標(biāo)本試劑成本為34.73元，較經(jīng)典RLA法節(jié)約了成本19.69元。 結(jié)論： 建立的微量平板RBA法靈敏度、特異性、重復(fù)性好，與經(jīng)典RLA法一致性高，臨床初步應(yīng)用效果良好，能適用于末梢血的檢測(cè)，易于自動(dòng)化且降低檢測(cè)成本，具有較好的臨