基于脂質(zhì)體納米粒子的生物傳感器在生化分析中的應(yīng)用.pdf

1、霍亂是一種嚴(yán)重的傳播廣泛的流行性疾病，大多數(shù)霍亂病例發(fā)生在不發(fā)達(dá)國家，已成為世界上亟待解決的一個嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題?；魜y毒素是霍亂弧菌分泌的一種蛋白質(zhì)腸毒素，是霍亂弧菌的一個典型生物標(biāo)記物，所以對霍亂毒素的快速、超靈敏檢測對霍亂流行病的防疫、控制和治療具有十分重要的意義。近年來，前列腺癌已經(jīng)成為成年男性群體中一項常見癌癥，且危害嚴(yán)重。目前臨床上對癌癥標(biāo)記物的檢測方法普遍操作復(fù)雜、儀器昂貴且需要專業(yè)技能。從而需要開發(fā)更加簡便、靈敏、定量準(zhǔn)確

2、且易于臨床推廣的生物傳感技術(shù)。此外，地中海貧血又稱海洋性貧血，是由于珠蛋白基因的缺失或點突變所致的一組遺傳性溶血性貧血。該病以地中海沿岸國家和東南亞各國多見，我國長江以南各省均有報道，以廣東、廣西、海南、四川、重慶等省區(qū)發(fā)病率較高，是非常嚴(yán)重的遺傳性疾病。故開發(fā)靈敏、準(zhǔn)確的基因單堿基突變檢測方法，對地中海貧血癥的診斷有很大意義。 利用化學(xué)與生物傳感技術(shù)檢測疾病標(biāo)志物，進(jìn)行臨床疾病的準(zhǔn)確、快速診斷以及流行病的現(xiàn)場篩查與群體監(jiān)控，是

3、當(dāng)前醫(yī)學(xué)上既新穎又極具吸引力的熱門研究課題之一。近年來，納米材料得到廣泛的研究與應(yīng)用，研究表明將納米材料應(yīng)用于生物傳感器的制備可以較大的提高傳感器的響應(yīng)性能。脂質(zhì)體是一種在水相中由磷脂雙分子定向排列而成的直徑幾納米至幾微米的超微粒子。脂質(zhì)體納米粒子可以通過內(nèi)部包埋或表面修飾方法成為多功能團(tuán)分子的通用載體且具有良好的生物相容性，本論文將不同功能化的脂質(zhì)體用作生物傳感界面的構(gòu)建和信號放大探針，并與相適宜的檢測手段聯(lián)用，構(gòu)建了一系列基于脂質(zhì)體

4、的新型生物傳感器。納米金制備簡單，比表面積大，生物相容性好，是固定生物分子常用的有效載體。有文獻(xiàn)報道，電極表面通過自組裝納米金層固定抗體，可以大大增加電極表面積和抗體固定量，同時保持抗體活性，是很好的傳感界面修飾方法。另外，碳納米管具有隧道效應(yīng)、特殊的電化學(xué)、光化學(xué)等物化性質(zhì)，是目前科研領(lǐng)域中最熱門的一維納米材料之一。碳納米管的功能化修飾是將其應(yīng)用于生物體系必須解決的一個關(guān)鍵問題。DNA修飾碳納米管的研究為碳納米管在基因檢測中的應(yīng)用提供

5、了科學(xué)基礎(chǔ)和強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。 本論文以霍亂毒素，甲胎蛋白，前列腺特異性抗原等重大疾病標(biāo)志物為檢測對象，構(gòu)建了一系列基于脂質(zhì)體納米顆粒的生物傳感器(第1部分)。具體內(nèi)容包括： (1)首次研制了一種基于脂質(zhì)體的壓電免疫凝集檢測(PEIA)技術(shù)用于對人免疫球蛋白(hIgG)和甲胎蛋白(AFP)的直接定量檢測。以脂質(zhì)體替代傳統(tǒng)膠乳顆粒標(biāo)記抗體，并采用牛血清白蛋白修飾壓電探針，直接對脂質(zhì)體顆粒免疫凝集所引起的溶液粘彈性變化進(jìn)行響

6、應(yīng)。其定量檢測hIgG的濃度范圍為0.05～6μgmL-1：將之用于臨床樣品分析，定量能力與經(jīng)典的ELISA法相接近。用所構(gòu)建的生物傳感器對AFP實際臨床樣品檢測，結(jié)果證明該方法應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測的可行性。與經(jīng)典的質(zhì)量型壓電免疫檢測技術(shù)相比，這種基于脂質(zhì)體的壓電免疫凝集檢測(PEIA)無需在石英晶振表面固定抗原或抗體，具有簡單、快捷、可再生的檢測優(yōu)勢。 (2)開發(fā)了一種基于神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)識別和脂質(zhì)體界面凝集的壓電生物傳感技

7、術(shù)對霍亂毒素進(jìn)行快速、定量檢測。石英晶振傳感界面修飾含GM1的支撐磷脂膜，檢測介質(zhì)中含有GM1修飾的脂質(zhì)體顆粒，這兩者構(gòu)建了壓電界面凝集生物傳感器。目標(biāo)物霍亂毒素會引起檢測介質(zhì)中GM1修飾的脂質(zhì)體在含有GM1的傳感界面上發(fā)生特異性凝集，同時引起晶體表面巨大的質(zhì)量負(fù)載和溶液粘彈性的變化，結(jié)合了壓電質(zhì)量效應(yīng)和非質(zhì)量效應(yīng)，與傳統(tǒng)模式的壓電頻率響應(yīng)信號相比放大了數(shù)倍，具有響應(yīng)快速、可再生的優(yōu)勢。其定量檢測霍亂毒素的濃度范圍為0.1～5μg mL

8、-1，檢測下限達(dá)到25 ng mL-1。 (3)提出了一種以脂質(zhì)體為信號放大載體的酶催化增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光傳感技術(shù)對霍亂毒素的超靈敏檢測。用含GM1的支撐磷脂膜為生物傳感界面檢測目標(biāo)物霍亂毒素，再用表面修飾了GM1受體和辣根過氧化物(HRP)酶的脂質(zhì)體為檢測探針對目標(biāo)物夾心檢測。最后利用HRP酶為催化劑，對碘苯酚為增強(qiáng)劑的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法對霍亂毒素進(jìn)行定量檢測。本傳感器實現(xiàn)了對霍亂毒素的超靈敏檢測，檢測下限可達(dá)到0.8 pg mL-1，

9、同時具有簡單、可再生的優(yōu)勢。將傳感器用于血清樣品分析，其檢測結(jié)果與ELISA試劑盒檢測結(jié)果相一致。 (4)發(fā)展了一種基于包酶脂質(zhì)體的化學(xué)發(fā)光生物傳感技術(shù)對前列腺癌特異性抗原的超靈敏檢測。以表面修飾了抗體、內(nèi)部包被HRP酶的脂質(zhì)體替代傳統(tǒng)酶標(biāo)抗體對界面識別的抗原夾心檢測，并采用表面活性劑釋放所固定脂質(zhì)體中的酶分子，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒放大酶催化化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，間接檢測前列腺特異性抗原。實現(xiàn)了對目標(biāo)物的超靈敏檢測，檢測下限可達(dá)到4 p

10、g mL-1。 在第一部分中，不同形式和性能的功能化脂質(zhì)體被合理運用，并結(jié)合使用多種檢測方法，提高了生物傳感器的分析性能。此外，我們還構(gòu)建了幾種基于其他納米粒子的電化學(xué)生物傳感技術(shù)，其中納米粒子被用于生物分子的固定或檢測探針的制備(第2部分)。納米金比表面積大，生物相容性好，是固定生物分子常用的有效載體。具體內(nèi)容包括： (5)構(gòu)建了一種以納米金顆粒為固定化材料和多步信號放大探針的電化學(xué)阻抗免疫傳感器對hIgG的超靈敏檢測

11、。將納米金顆粒自組裝于己二硫醇修飾的金電極表面，利用納米金層吸附抗體，構(gòu)建了一種納米金界面吸附的生物分子固定化方法。信號放大步驟為：用納米金標(biāo)記的抗體做為第一步放大探針，然后分別用納米金標(biāo)記的二抗和納米金標(biāo)記的抗體交替反應(yīng)，進(jìn)行多步信號放大?；诩{米金界面固定抗體，具有抗體固定量大、免疫活性強(qiáng)、操作穩(wěn)定性高等優(yōu)點?；诩{米金的信號放大技術(shù)極大的提高了傳感器的靈敏度，對目標(biāo)物hIgG的線性檢測范圍為15.3～328.3 ng L-1。

12、 (6)通過自組裝納米金層固定具有堿基突變識別能力的MutS蛋白，MutS蛋白能捕獲含堿基突變的DNA雙鏈并以亞甲基蘭在DNA雙鏈中的嵌入作為電化學(xué)響應(yīng)信號來檢測單堿基突變核酸鏈。該方法成功地實現(xiàn)了對β—地中海貧血癥基因的-28位點的單個堿基突變的識別，檢測限達(dá)到5.66×10—13 M，對點突變的檢測具有快速、靈敏度高、成本低的特點。對實際樣品的兩步檢測方法可實現(xiàn)樣品的基因分型，即將樣品分類為變異雜合子，野生純合子和變異純合子。

13、 (7)單壁碳納米管具有隧道效應(yīng)、特殊的電化學(xué)、光化學(xué)等物化性質(zhì)，將其作為納米材料探針與電化學(xué)方法聯(lián)用可以超靈敏的檢測核酸單鏈，構(gòu)建了新型的核酸檢測方法。檢測原理：將單壁碳納米管與核酸檢測探針混合機(jī)械超聲，制備核酸檢測探針修飾的水溶液分散的單壁碳納米管。與目標(biāo)DNA鏈的雜交反應(yīng)會使檢測探針解離離開碳管表面，裸露的單壁碳納米管繼而吸附在疏水的電極表面，由于其特有的隧道效應(yīng)使原本絕緣的電極導(dǎo)通，從而檢測到氧化還原電子對在電極表面實現(xiàn)電