Bacterial toxin-antitoxin svstems ChpK-ChpI and MazF-MazE play a role in the virulence of pathogenic leptospiral species.pdf

1、背景(background)：鉤端螺旋體(簡稱鉤體)分為致病性鉤體和非致病性鉤體兩大類，前者引起人或動物疾病，后者屬于非致病腐生性原核細胞型微生物。目前發(fā)現(xiàn)，致病性鉤體可分為7個基因種，其中問號鉤體基因種(Leptospirainterrogans)流行最為廣泛，如黃疸出血群、波摩那群、秋季群等；其次為波帕特森基因種(Leptospiraborgpetersenii)，如流感傷寒群。由致病性鉤體感染引起的鉤體病是全球流行的人畜共患傳染病

2、，中國及東南亞地區(qū)是鉤體病流行的主要疫區(qū)，其次是巴西等南美地區(qū)國家。人類感染致病性鉤體后，首先出現(xiàn)中毒性敗血癥癥狀，如高熱、頭痛、肌痛等；然后因鉤體侵入肺、肝、腎等臟器及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，出現(xiàn)出血、黃疸及呼吸或腎功能衰竭癥狀，因主要受損臟器不同，臨床上可分為六型，其中肺彌漫性出血(pulmonarydiffusehemorrhage，PHD)型鉤體病死亡率高達50％～75％。以往生物學實驗證明，致病性鉤體不產(chǎn)生任何典型的外毒素，業(yè)已公布的2

3、株致病性鉤體全基因組序列中，也未發(fā)現(xiàn)有任何編碼經(jīng)典外毒素基因。致病性鉤體脂多糖(LPS)的內(nèi)毒素毒性僅為大腸桿菌LPS的1/10～1/100。盡管有文獻報道，致病性鉤體編碼溶血素基因明顯多于非致病性鉤體，但僅憑溶血素難以解釋致病性鉤體強大的致病能力。因此，致病性鉤體毒力因子及其致病機制至今所知甚少。
　　 近年發(fā)現(xiàn)，不少細菌具有毒素-抗毒素系統(tǒng)，該系統(tǒng)通常由一個操縱子中的兩個基因編碼，其中一個基因編碼有毒性的核酸酶，另一個基因編

4、碼抗毒蛋白，抗毒蛋白能與核酸酶結(jié)合，使核酸酶失去毒性。目前認為，細菌毒素-抗毒素系統(tǒng)主要在營養(yǎng)缺乏等不利環(huán)境條件下，發(fā)揮利它性自殺功能，從而確保物種生存與延續(xù)。但最近有文獻報道，大腸桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)可能在細菌致病過程中發(fā)揮作用。流行最廣的問號鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組中，存在chpIK和mazEF兩個操縱子，其表達產(chǎn)物可分別組成ChpI/ChpK和MazE/MazF兩個毒素-抗毒素系統(tǒng)。然而，至今未見致病性鉤體ChpI/ChpK和

5、MazE/MazF毒素-抗毒素系統(tǒng)及其致病性的研究報道。
　　 目的(aim)：了解問號鉤體黃疸出血群賴型賴株ChpI/ChpK和MazE/MazF兩個毒素-抗毒素系統(tǒng)中的毒性蛋白ChpK和MazF的功能及其對人單核巨噬細胞株(THP-1)細胞和人腎小管上皮細胞(HEK293)的毒性作用。
　　 方法(methods)：以致病性問號鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組DNA為模板，采用PCR擴增全長chpI、mazE基因及chp

6、IK和mazEF操縱子片段，采用pET42a為表達載體、EcoliBL21DE3為表達宿主菌，分別構(gòu)建上述基因及操縱子原核表達系統(tǒng)。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢測目的重組蛋白rChpI、rChpK和rMazE、rMazF表達情況及表達量，Ni-NTA親和層析法提純rChpI、rChpK和rMazE、rMazF。通過水解問號鉤體賴株及THP-1細胞的基因組DNA和總RNA實驗，了解rChpI、rChpK和rMaz

7、E、rMazF有無核酸酶活性。采用實時熒光定量RT-PCR，檢測問號鉤體賴株感染THP-1細胞前后chpI、chpK和mazE、mazF基因表達水平變化。采用WesternBlot法，檢測問號鉤體賴株感染THP-1細胞前后ChpI、ChpK和MazE、MazF表達及外分泌情況。采用免疫熒光標記及激光共聚焦顯微鏡，檢測問號鉤體賴株ChpI、ChpK和MazE、MazF在THP-1細胞內(nèi)表達與外分泌情況。分別構(gòu)建chpI、chpK和mazE

8、、mazF基因真核表達載體并轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，采用CCK-8試劑檢測ChpI、ChpK和MazE、MazF對細胞活性的影響。
　　 結(jié)果(results)：所克隆的chpI、mazE基因及chpIK和mazEF操縱子核苷酸序列與文獻報道完全相同。所構(gòu)建的原核表達系統(tǒng)能分別表達rChpI、rMazE以及rChpI/rChpK、rMazE/rMazF蛋白。利用設(shè)置在chpI、chpK和mazE、mazF基因片段3’端6×His

9、標簽，不僅高效地提純了rChpI、rMazE，同時也從rChpI與rChpK、rMazE與rMazF混合表達產(chǎn)物中提純了毒性蛋白rChpK和rMazF，解決了因rChpK和rMazF毒性而不能在大腸桿菌中表達的難題。rMazF可水解RNA，但不水解DNA；rChpK既不水解RNA，也不水解DNA。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，問號鉤體賴株感染THP-1細胞后，chpI、chpK、mazE、mazFmRNAs水平顯著升高。WesternBl

10、ot結(jié)果顯示，問號鉤體賴株感染THP-1細胞后，ChpI、ChpK、MazE和MazF表達上調(diào)，毒性蛋白ChpK和MazF有外分泌的現(xiàn)象，抗毒性蛋白ChpI和MazE則否。問號鉤體賴株感染的THP-1細胞胞質(zhì)內(nèi)可發(fā)現(xiàn)毒性蛋白ChpK和MazF，但未檢測到抗毒蛋白ChpI和MazE。轉(zhuǎn)染mazF基因的HEK293細胞活性明顯下降并大量死亡，轉(zhuǎn)染chpK基因的HEK293細胞活性也有所下降。
　　 結(jié)論(conclusion)：Ch