Sonic hedgehog (Shh)對大鼠永久性腦缺血的潛在治療作用及機制研究.pdf

1、目的:研究Shh蛋白對大鼠永久性腦缺血模型的保護作用及其潛在機制。
　　方法:原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞1-2代后,應用糖氧剝奪模擬體外缺血模型,分別給予rHu Shh、Cyclopamine預處理,選取2小時、4小時或6小時三個作用時間點為檢測終點,用MTT法或 BrdU染色法檢測細胞存活和細胞增殖;建立大鼠永久性腦缺血模型,側腦室注射rHu Shh或PBS,觀察神經(jīng)行為學評分,應用TTC法檢測腦梗塞面積,干濕稱重法檢測腦水腫,依

2、文思藍外滲法檢測血腦屏障通透性,激光散斑襯比技術檢測皮層血流灌注,免疫組織化學法檢測缺血梗塞區(qū)邊緣CD31和α-SMA的陽性表達,用CD31和Ki-67兩種抗體進行免疫熒光雙標,用共聚焦顯微鏡觀察缺血梗塞區(qū)邊緣內(nèi)皮細胞增殖狀況。應用實時熒光定量PCR的方法檢測Sonic hedgehog(Shh)信號通路中的關鍵成份(Shh,Patched-1,Gli-1)及血管新生因子(VEGF、Ang-1和Ang-2)的mRNA水平,用免疫印跡法(

3、Western blotting)檢測上述因子的蛋白水平。
　　結果:1)rHu Shh可促進OGD處理下原代培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細胞的存活和增殖能力;2)大鼠永久性腦缺血模型后24小時可見腦組織Shh,Patched-1,Gli-1的mRNA水平和蛋白水平的表達增高,而側腦室給予rHu Shh可以進一步提高Patched-1的蛋白表達水平;3)側腦室給予rHu Shh可以顯著減輕腦缺血導致的神經(jīng)功能缺損,降低梗塞面積,減輕腦水腫,

4、改善血腦屏障通透性,提高皮層血流灌注;4)側腦室給予rHu Shh可以增加缺血梗塞區(qū)邊緣CD31和α-SMA陽性表達的細胞,增加CD31和Ki-67共定位的陽性細胞;5)側腦室給予rHu Shh,在大鼠永久性腦缺血模型后24小時的腦組織可見VEGF和Ang-1的mRNA水平和蛋白水平的表達增高。
　　結論:Shh對缺血損傷的腦微血管內(nèi)皮細胞具有保護作用;腦缺血后Shh信號通路存在激活;外源性給予Shh可調(diào)控血管新生因子的表達,促進