人類BMP-2基因在兔骨髓MSCs的表達(dá)及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：(1)分離兔骨MSCs，體外培養(yǎng)擴(kuò)增，觀察其生物學(xué)性狀及條件培養(yǎng)下成骨分化情況。(2)提取HBMP-2 cDNA，構(gòu)建其真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-hBMP2。(3)將pIRES2-EGFP-hBMP2轉(zhuǎn)染兔MSCs，觀察}1BMP-2 cDNA在兔MSCs的表達(dá)情況及其誘導(dǎo)成骨情況，探討其作用機(jī)制。 方法：(1)抽取兔髂骨及脛骨的骨髓液，密度梯度離心法分離出MSCs，體外純化鑒定培養(yǎng)擴(kuò)增，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞

2、的生物學(xué)性狀。取第2代MSCs在條件培養(yǎng)基下成骨誘導(dǎo)，測定其ALP活性及成骨礦化情況。(2)RT-PCR方法獲取人骨肉瘤細(xì)胞中的hBMP-2 cDNA，將此片段重組到pMDl8-T克隆載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a篩選擴(kuò)增，并測序目的基因；酶切pMDl8T-BMP2中的hBMP-2 cDNA，定向克隆到pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體中，篩選擴(kuò)增并鑒定重組質(zhì)粒。 (3)用電穿孔法將pIRES2-EGFP-hBMP2轉(zhuǎn)染至兔MSCs中

3、，熒光顯微鏡下及流式細(xì)胞學(xué)檢查觀察轉(zhuǎn)染效果、檢測轉(zhuǎn)染效率，定量RT-PCR方法觀察hBMP-2 cDNA在兔MSCs中的轉(zhuǎn)錄情況，免疫組織化學(xué)及western b10t方法檢測MSCs中hBMP-2蛋白表達(dá)情況。連續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的兔MSCs，檢測ALP活性及成骨礦化情況，觀察表達(dá)的hBMP-2蛋白功能情況。 結(jié)果：(1)兔MSCs為均一的成纖維形細(xì)胞，漩渦狀貼壁生長，增殖成力強(qiáng)。在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)，兔MSCs具有向成骨細(xì)胞表型分化

4、能力，細(xì)胞內(nèi)ALP活性明顯增強(qiáng)，可在兩周時(shí)形成鈣化結(jié)節(jié)。(2)從人骨肉瘤細(xì)胞中提取到hIBMP-2 cDNA，經(jīng)測序后證明為hBMF-2基因全編碼序列，并成功地構(gòu)建hBMP-2 cDNA的真核表達(dá)載體。(3)電穿孔方法可以將質(zhì)粒pIRES2-EGFP-laBMP2轉(zhuǎn)染至兔MSCs中，熒光顯微鏡下觀察到強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率為(42.7±2.1)％。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后定量RT-PCR方法可以檢測到hBMP-2 cDNA在

5、兔MSC中的逆轉(zhuǎn)錄片斷，免疫組織化學(xué)及western blot方法均觀察到兔MSC中有hBMP-2蛋白。培養(yǎng)電轉(zhuǎn)染后的兔MSCs，增殖能力較未轉(zhuǎn)化組強(qiáng)，其細(xì)胞內(nèi)ALP活性增強(qiáng)，可形成鈣化結(jié)節(jié)。 結(jié)論：(1)密度梯度離心法可分離到兔MSCs，體外培養(yǎng)性狀穩(wěn)定，增殖力強(qiáng)，具有成骨分化潛能，是骨組織工程中的理想種子細(xì)胞。 (2)體外基因重組技術(shù)可以成功地獲取hBMP-2 eDNA并構(gòu)建其真核表達(dá)載體。(3)hBMP-2 eDNA可在