大豆苗期磷代謝生理參數(shù)和大豆新型植酸酶基因（Sphy1）克隆.pdf

1、植酸酶是重要的飼料添加劑，在提高動(dòng)物對(duì)飼料磷素的利用效率中具有重要價(jià)值。創(chuàng)制超表達(dá)植酸酶基因的轉(zhuǎn)基因作物，對(duì)于增強(qiáng)作物對(duì)土壤中有機(jī)態(tài)磷的利用，也具有重要的實(shí)踐意義。本項(xiàng)研究以大豆品種科豐6為材料，對(duì)大豆種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)期間種子和植株中植酸酶活性和磷素代謝生理參數(shù)進(jìn)行了研究。采用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆了大豆新型植酸酶基因Sphyl,對(duì)Sphyl的基因結(jié)構(gòu)、時(shí)空表達(dá)特性進(jìn)行了分析。在構(gòu)建Sphyl雙元表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，建立了煙草的轉(zhuǎn)基因系，

2、研究了轉(zhuǎn)基因植株的植酸酶活性。主要結(jié)果如下: 1、對(duì)不同幼苗生長(zhǎng)時(shí)期的各器官植酸酶活性、磷素代謝和相關(guān)生理指標(biāo)的研究發(fā)現(xiàn)，在幼苗生長(zhǎng)前期(播種后10d和20d)，子葉中具有較高的植酸酶活性，且表現(xiàn)為隨著生長(zhǎng)進(jìn)程植酸酶活性呈增加的趨勢(shì)。表明貯存在種子中的貯磷物植酸及其鹽類，在幼苗生長(zhǎng)前期被大量的降解，以滿足植株新生器官分化和生長(zhǎng)所需要的磷素。在根、莖和葉等營(yíng)養(yǎng)器官中，也具有較高的植酸酶活性，可能參與了器官中其他有機(jī)態(tài)磷的代謝過程。

3、研究表明，大豆苗期植株體內(nèi)各器官在磷素降解和合成的代謝中存在著精細(xì)的調(diào)控機(jī)制。 2、隨著幼苗生長(zhǎng)進(jìn)程，伴隨著子葉中植酸酶活性的變化，以及協(xié)同的酸性磷酸酶活性的變化和相關(guān)的磷素代謝過程，植株體內(nèi)的無機(jī)磷(Pi)含量、植株磷累積總量、全氮含量、可溶蛋白含量以及植株的鮮、干重均發(fā)生明顯的變化。外源生長(zhǎng)介質(zhì)中的氮、磷供應(yīng)水平對(duì)子葉、葉片、莖和根等各器官的植酸酶活性、酸性磷酸酶活性以及相關(guān)的磷素代謝和生理參數(shù)均產(chǎn)生了較明顯的影響。生產(chǎn)中，

4、增加苗期氮磷營(yíng)養(yǎng)對(duì)于改善幼苗生長(zhǎng)期間的磷、氮素代謝和實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、高效具有重要作用。 3、采用RT-PCR技術(shù)，克隆了新型大豆植酸酶基因Sphyl。Sphyl開放閱讀框(ORF)為1644bp，編碼547個(gè)氨基酸。Sphyl的分子量為62.13 kD，等電點(diǎn)為5.21。在N-端，Sphyl含有一個(gè)由27個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列。表明，通過翻譯后修飾的Sphyl具有靶向細(xì)胞原生質(zhì)膜或分泌至細(xì)胞外部的能力。 4、對(duì)大豆幼苗不同生

5、長(zhǎng)時(shí)期子葉、葉片、莖和根中的Sphyl的表達(dá)特性研究發(fā)現(xiàn)，在播種后5d的子葉中，即檢測(cè)到了Sphyl的表達(dá)。與5d相比，在子葉播種后10d，Spbyl的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，以后至30d，隨著生長(zhǎng)進(jìn)程，表達(dá)水平呈不斷增加的趨勢(shì)。在10d、20d和30d，葉、莖和根中Sphyl也具有較高的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，Spkyl在各測(cè)定時(shí)期、各器官中的表達(dá)水平與各自的植酸酶活性表現(xiàn)規(guī)律一致，表明，Sphyl在調(diào)控幼苗生長(zhǎng)期間各器官的植酸酶活性中具有較重

6、要的作用。 5、采用DNA重組和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，構(gòu)建了融合Sphyl的植物雙元表達(dá)載體，建立了上調(diào)表達(dá)Sphyl的煙草轉(zhuǎn)基因系。對(duì)10個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定結(jié)果表明，獲得的轉(zhuǎn)基因植株均為陽性。對(duì)10個(gè)轉(zhuǎn)基因系的Sphyl表達(dá)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Sphyl轉(zhuǎn)基因系中的表達(dá)水平存在較大差異，可大致劃分為強(qiáng)、較強(qiáng)、中和弱等不同水平類型。 6、以2個(gè)對(duì)照植株和10個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的葉片樣本為材料，測(cè)定了各供試材料的植酸酶活性。發(fā)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化