人工發(fā)酵蟲草菌絲體干粉對1型糖尿病大鼠腎臟保護作用的實驗研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathv，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最主要的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎功能衰竭(ESRF)的主要病因。目前在我國，DN發(fā)病率呈逐年上升趨勢。探索DN發(fā)病機制，制定更加有效的防治措施，已成為當前糖尿病學界和腎臟病學界十分熱點的課題。中醫(yī)藥防治DM歷史悠久，經(jīng)驗豐富，有獨特的學術(shù)體系。中藥具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點的作用特點，很多研究表明中藥在降糖的同時，

2、能增強患者體質(zhì)，糾正糖、蛋白質(zhì)和脂肪代謝紊亂。冬蟲夏草[Cordyceps sinensis(Berk．)Sacc．]為麥角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體，傳統(tǒng)醫(yī)學認為其入肺、腎經(jīng)，有補肺腎、益虛損、扶精氣之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，DN的主要病理改變是腎基底膜增厚和以腎小球系膜區(qū)為主的細胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)沉積。Ⅳ型膠原(collagentypeⅣ，Col-Ⅳ)是ECM增殖的

3、主要成分，是導致DN的主要病理基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化生長因子-β<,1>(transforming．growth factor-β<,1>，TGF-β<,1>)儲存于細胞表面或細胞外基質(zhì)(ECM)中，介導血糖升高對腎臟的多種化學反應，被認為是DN系膜細胞增生和ECM生成過多的重要媒介之一。DM時，糖、脂代謝紊亂使氧化自由基產(chǎn)生增多，升高的自由基能夠直接損傷腎臟組織；同時高糖還可以影響清除自由基的各種抗氧化酶(總超氧化物歧化酶(TSOD)、過氧化氫酶

4、(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)等的活性，使損傷加重。本研究通過鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘發(fā)Sprague-Dawlay(SD)大鼠胰島功能缺陷和高血糖，復制1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T<,1>DM)大鼠模型，并應用人工發(fā)酵蟲草菌絲體干粉(冬蟲夏草代用品)進行干預治療。運用生物化學、病理形態(tài)學等方法

5、檢測腎臟組織中Cik-Ⅳ、TGF-β<,1>的表達情況和TSOD、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、CAT、GSH-PX的活性水平，探討ECM增生、氧化應激與DN病變的關(guān)系以及人工發(fā)酵蟲草菌絲體干粉的腎臟保護作用機理。 方法：從60只8周齡SD大鼠中隨機抽取12只作為正常對照組(A組)，其余作為實驗組。將實驗組大鼠給予STZ55mg/kg腹腔注射，72小時后測尾尖血糖大于16.8mmol/L，持續(xù)3天，確認為1型

6、糖尿病動物模型。把糖尿病大鼠隨機分為糖尿病對照組(B組)、人工發(fā)酵蟲草菌絲體干粉干預治療組：1.2g/kg/d干預組(C組)、2.4g/kg/d干預組(D組)、3.6g/kg/d干預組(E組)。于第16周末測量大鼠體重，測定血糖(BG)、血中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)以及極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、24小時尿肌酐清除

7、率(Ccr)和24小時尿白蛋白排泄量(urinary albumin excretion，UAE)水平。以腎組織制備光鏡及電鏡切片，進行形態(tài)學觀察；通過苦味酸.甲苯胺藍染色法檢測ECM含量；應用免疫組化方法檢測Col-Ⅳ、TGF-β<,1>在腎臟組織中的蛋白表達水平，并用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，計算Col-Ⅳ、TGF-β<,1>的積分光密度值(IOD)的積分均值。應用黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法等生物化學方法檢測TSOD、

8、MDA、CAT、GSH-PX的活性。使用SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，兩組比較采用t/t'檢驗，組間比較采用方差分析。 結(jié)果：1 實驗第4周末檢測指標：實驗組大鼠體重小于正常對照組(P<0.05)，BG水平均高于正常對照組(均P<0.01)。 2 實驗第16周末生化指標：B組大鼠BG、TG、TC、LDL-C及VLDL-C水平均高于A組，HDL-C水平低于A組(均P<0.05)；C組、D組、E組大鼠TG、TC、LD

9、L-C、VLDL-C水平均低于B組，HDL-C均水平高于B組(均P<0.05)，C組、D組、E組之間上述指標無顯著性差異(均P>0.05)。C組、D組血糖水平較B組、E組顯著下降(均P<0.05)，B組、E組之間無顯著性差異(均P>0.05)。B組大鼠血BUN、Scr、尿UAE明顯高于A組大鼠(均.P<0.01)。C組、D組、E組血BUN、Scr、尿UAE均較B組顯著下降，其中E組較B組下降最明顯，均有顯著性差異(分別P<0.05，P<

10、0.05，P<0.01)。B組Ccr水平明顯低于A組(P<0.05)，C組、D組、E組Ccr較B組顯著升高(P<0.05)，其中E組Ccr較B組升高更明顯(p<0.01)。 3 組織形態(tài)學結(jié)果：HE及苦味酸.甲苯胺藍染色示B組大鼠腎小球面積增大，襻腔擴張，系膜基質(zhì)顯著增生，部分小球表現(xiàn)為結(jié)節(jié)樣硬化，腎小球基底膜及囊壁增厚。(腎小管沒有描述)電鏡觀察示B組腎小球基底膜不規(guī)則增厚，系膜區(qū)擴張，系膜基質(zhì)增多；C組、D組、E組均較B組明

11、顯減輕，E組減輕最明顯。 4 腎臟組織TGF-β<,1>、Col-Ⅳ蛋白表達：TGF-β<,1>染色陽性面積占腎小管-間質(zhì)面積百分比(％)的結(jié)果證實在B組TGF-β<,1>染色陽性比例(21.24±2.45)相對于A組(5.85±0.65)明顯增多(p<0.01)；C組(13.90±1.71)、D組(9.72±2.02)、E組(7.82±2.09)相對于B組，TGF-β<,1>染色陽性比例有不同程度的減輕，減輕程度隨劑量增加而增加

12、三組之間有顯著性差異(均為p<0.05)。光鏡下，Col-Ⅳ在A組腎小球系膜、基底膜及腎小管-間質(zhì)有少量表達，B組的表達明顯增強，C組、D組、E組增生情況較B組明顯減弱。圖像分析示：B組Col-Ⅳ的IOD(13.02±1.74)明顯高于A組(6.27±0.72)(p<0.01)，C、D、E組IOD(分別為10.24±1.32，9.02±1.20，7.92±1.18)較B組顯著降低(均為p<0.01)，其中E組IOD較C、D組降低更明顯，

13、有顯著性差異(p<0.05)。相關(guān)分析表明TGF-β<,1>的表達水平與Col-Ⅳ水平呈顯著負相關(guān)(r=-0.509，p<0.01)。 5 腎臟組織各種抗氧化酶的活性：抗氧化酶TSOD、CAT活性在B組(分別為55.25±2.46u/mgpro、26.31±2.09u/mgpro)較A組(分別為79.55±4.67u/mgpro、47.95±3.05u/mgpro)明顯下降， C組(分別為60.34±2.02u/mgpro、31

14、.03±2.04u/mgpro)、D組(分別為67.26±2.01u/mgpro、33.47±1.09u/mgpro)、E組(分別為66.22±1.09u/mgpro、37.25±1.34u/mgpro)較B組均明顯下降(均為p<0.05)：GSH-PX活性在B組(79.17±2.12活力單位)、C組(88.68±3.17活力單位)、D組(84.12±4.13活力單位)、E組(98.10±2.02活力單位)較A組(62.95±2.94活

15、力單位)均明顯升高，有顯著性差異(均為p<0.05)。 6 腎臟組織中MDA水平：B組MDA水平(18.19±1.02nmol/mgpro ) 顯著高于 A 組(7.41±0.83nmol/mgpro)，C組(9.38±0.46nmol/mgpro)、D組(8.39±0.89nmol/mgpro)、E組(8.00±0.69nmol/mgpro)，各組間均有顯著性差異(p<0.01或p<0.05)。 結(jié)論 1 STZ DM

16、大鼠腎臟局部TGF-β<,1>、Col-Ⅳ的蛋白表達明顯高于正常大鼠，提示腎組織中TGF-β<,1>、Col-Ⅳ的表達改變與DN發(fā)生密切相關(guān)。 2 STZ DM大鼠腎臟組織中，反應性氧產(chǎn)物較正常大鼠明顯增多，而抗氧化酶活性明顯下降，提示糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展可能與氧化應激水平密切相關(guān)。 3 人工培養(yǎng)蟲草菌絲體干粉通過減少尿白蛋白排泄、調(diào)節(jié)血脂、降低血糖、改善組織氧化應激水平、調(diào)節(jié)TGF-β<,1>的蛋白表達，減輕Col-