糖尿病大鼠腎臟中MMP-2、TIMP-2表達變化及蟲草菌絲干預(yù)作用研究.pdf

1、目的： 觀察蟲草菌絲對治療前后糖尿病大鼠腎臟組織中基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子2(TIMP-2)表達的變化，分析其與纖維化相關(guān)指標Ⅳ型膠原(ColⅣ)等的相關(guān)關(guān)系，來探討蟲草菌絲對糖尿病大鼠的腎臟保護作用及MMP-2和TIMP-2在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。目前，尚未見相同的研究報道。 研究方法： 1.動物分組及處理：34只雄性Wistar大鼠行右腎切除術(shù)，1周后將存活的33

2、只隨機分為甲組(10只)和乙組(23只)。乙組給予一次性腹腔內(nèi)注射STZ(53mg/kg)誘導糖尿病模型，甲組僅給予等量無菌枸櫞酸鈉緩沖液。72h后，尾靜脈采血測隨機血糖≥16.7mmol/L者確定為DM模型，共21只，將其隨機分為：糖尿病模型組(DM組，11只)、蟲草菌絲干預(yù)組(CH組，10只)；另將甲組大鼠設(shè)為陰性對照組(NC組)。CH組在糖尿病模型建成后即刻給予蟲草菌絲懸濁液(4.95g·kg-1·d-1)灌胃，NC組和DM組僅給

3、予等量生理鹽水(15ml·kg-1·d-1)灌胃。實驗期間所有大鼠自由飲水進食，各組大鼠不使用胰島素及其他降糖藥物。所有大鼠每周測一次體重及血糖。 2.干預(yù)第8周末留取大鼠24h尿液并檢測其尿肌酐(Ucr)、24h尿蛋白定量(Upro)等，進行組間差異比較并分析各指標之間的相關(guān)性；干預(yù)8周后一次性處死大鼠，腹主動脈留取動脈血約4ml，測血糖(Glu)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)等，并計算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)。

4、 3.腎臟標本處理：取部分腎組織，剝離被膜，稱重，10％福爾馬林固定、石蠟包埋、切片。行HE染色及PAs染色鏡下觀察大鼠腎臟常規(guī)病理變化。SABC免疫組化方法檢測各組腎臟MMP-2、TIMP-2、Col-Ⅳ蛋白的表達情況。每張切片隨機取lO個高倍鏡視野(×400)，采用Leica Qwin V3圖像分析軟件，分析各指標陽性著色的灰度，比較三組之間灰度值。其余部分置于液氮保存，以行RT-PCR檢測腎組織中MMP-2、TIMP-2、ColⅣ

5、的mRNA水平。收集并整理實驗數(shù)據(jù)，應(yīng)用單因素方差分析、直線相關(guān)分析等進行統(tǒng)計分析，p<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： 1.試驗前各組大鼠體重、血糖基礎(chǔ)值無顯著性差異(p>0.05)，條件齊同。 2.8周后，DM組、CH組大鼠的血糖、Ccr、Upro水平均顯著高于NC組(p均<0.01)。CH組Ccr、Upro水平較DM組顯著降低(p均<0.01)，兩組血糖水平無顯著差異。 3.免疫組化及RT-PCR結(jié)

6、果均顯示DM組、CH組大鼠腎組織中TIMP-2、Col Ⅳ水平明顯高于NC組(p<0.01或p<0.05)，MMP-2水平及MMP-2/TIMP-2比值低于NC組(p<0.01或p<0.05)。 . 4.免疫組化及RT-PCR結(jié)果顯示CH組大鼠腎組織中TIMP-2、Col Ⅳ水平較DM組降低(p<0.01或p<0.05)，MMP-2水平及MMP-2/TIMP-2比值則升高(p均<0.01)。 5.相關(guān)分析：將各組大鼠腎臟

7、MMP-2、TIMP-2表達水平及MMP-2/TIMP比值與相應(yīng)的纖維化指標進行相關(guān)分析，結(jié)果顯示MMP-2和MMP-2/TIMP比值與大鼠Col Ⅳ表達、24小時尿蛋白定量均存在負相關(guān)關(guān)系，而TIMP-2與之正相關(guān)(p<0.01或p<0.05)。相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.394、r=-0.547、r=-0.655、r=-0.747、r=0.576、r=0.571。 結(jié)論： 1.DM大鼠腎臟出現(xiàn)DN病理改變，24小時尿蛋白

8、排泄量增多,腎組織中TIMP-2表達顯著升高，MMP-2表達及MMP-2/TIMP比值顯著降低，且MMP-2表達及MMP-2/TIMP比值與24小時尿蛋白排泄量呈顯著負相關(guān)，TIMP-2則與之呈正相關(guān)。提示M8P-2和TIMP-2的表達失衡與糖尿病腎病的發(fā)生及蛋白尿的形成密切相關(guān)。 2.DM大鼠腎組織中Col Ⅳ表達明顯升高，并分別與MMP-2及TIMP-2水平呈負相關(guān)及正相關(guān)，提示DM時，MMP-2表達的減少和TIMP-2表達